ساختار آنزیم COX-2 انسانی، شباهت بسیار زیادی به COX-1 گوسفندی دارد. ساختار سه بعدی این ایزوفرم به تنهایی و به صورت کمپلکس شده با تعدادی مهارکننده در اختیار می‌باشد. مطالعات ساختار سه بعدی آن نشان داده است که این ایزو فرم نیز همانند COX-1 دارای سه ناحیه می‌باشد.(۵۳)مهم‌ترین جلوه‌های ساختاری COX-2 که سبب حساسیت جهت مهار توسط مهارکنندگان انتخابی شده است، تغییر چند اسید آمینه در جایگاه فعال سیکلواکسیژنازی می‌باشد که سبب افزایش سایز و محیط شیمیایی پاکت اتصال COX-2 شده است. مهم‌ترین تغییر، جایگزینی والین در COX-2 با Ile⁵²³ (اسید آمینه‌ای که سطح جایگاه فعال COX-1 را می‌پوشاند) می‌باشد. این تغییر به والین کوچکتر، در COX-2 اجازه‌ی دسترسی به پاکت، یا برآمدگی در نزدیکی دهانه و در همسایگی کانال مرکزی پاکت اتصال را می‌دهد که سبب افزایش حجم جایگاه فعال COX-2 می‌گردد.
دومین جایگزینی والین در COX-2 با Ile⁴³⁴ (که در دومین لایه‌ی اسید آمینه‌های پوشاننده‌ی جایگاه فعال COX-1 قرار دارد) می‌باشد که سبب افزایش تحرک و انعطاف‌پذیری phe⁵¹⁸ شده که به این اسید آمینه اجازه می‌دهد تا از راه کنار رفته و در نتیجه سبب دسترسی به پاکت جانبی می‌گردد. به این ترتیب، کانال مرکزی بزرگتر و پاکت جانبی هر دو سبب شده‌اند که جایگاه فعال سیکلواکسیژنازی COX-2 حدوداً ۲۵% بزرگتر از COX-1 باشد.(۴۷)حضور این پاکت در COX-2، طیف وسیع‌تر سوبستراهایی که با این ایزوفرم اکسیده می‌شوند(اسیدهای چرب ۱۸ و ۲۰ کربنه)را توجیه می‌کند، علاوه بر این، حضور این پاکت علت اختصاصیت مهار کنندگی خانواده‌ی دی آریل هتروسیکل‌ها بر COX-2 می‌باشد. (۵۳) (شکل۲-۸)
شکل ۲-۸. نقش کلیدی جایگزینی اسید آمینه‌ی والین به جای ایزولوسین در COX-2 و افزایش حساسیت COX-2 در مهار اختصاصی توسط سلکوکسیب
دومین تعویض اساسی اسید آمینه‌ها بین COX-1 و COX-2 که سبب تغییر محیط شیمیایی پاکت اتصال می‌گردد، شامل جایگزینی آرژنین با His⁵¹³ در پاکت جانبی است که از طریق جایگزینی والین با ایزولوسین امکان‌پذیر می‌شود. واکنشض استخلافات ۴-متیل سولفونیل فنیل یا ۴- سولفونامویل فنیل مهار کنندگان دی آریل هتروسیکل‌ها با این آرژنین جهت مهار وابسته به زمان COX-2 توسط این مهار کنندگان ضروری به نظر می‌رسد. Arg⁵¹³ همچنین سبب افزایش اتصال و مهار وابسته به زمان مشتقات زومپیراک، دسته‌ای از مهار کنندگان می‌شود. به جای واکنش مستقیم با این مهار کنندگان، پیشنهاد شده است که Arg⁵¹³ تشکیل پیوندهای هیدروژنی با دو اسید آمینه‌ی دیگر در پاکت اتصال Glu⁵²⁴ و Tyr³⁵⁵ می‌دهد و سبب می‌گردد تا مهار کنندگان با پایه‌ی زومپیراک محکم‌تر اتصال یابند. (۴۷)
در قسمت فوقانی جایگاه فعال COX-2، Phe503 با لوسین جایگزین شده است. این جایگزینی علاوه بر ایجاد یک فضای اضافی در قسمت فوقانی، انعطاف‌پذیری بیشتری به سایر اسید آمینه‌ها در این ناحیه داده و به مهار کنندگان حجیم‌تری اجازه‌ی اتصال می‌دهد.(۵۳) نتیجه‌ی مهم این تغییر اسیدهای آمینه در COX-2،افزایش سایز پاکت اتصال است که اجازه می‌دهد این ایزوزیم نسبت به COX-1 با مهارکنندگان حجیم‌تری واکنش دهد.(شکل ۲-۹)
شکل ۲-۹. مقایسه‌ی جایگاه فعال سیکلواکسیژنازی COX-1 و COX-2
۲-۱-۵-۳-۵. مقایسه ی COX-1 و COX-2 در اتصال به مهارکننده‌های سیکلواکسیژناز
بر خلاف عملکردArg¹²⁰ در COX-1،Arg¹²⁰ تنها یک نقش فرعی جهت پیوند NSAIDها و سوبستراهای اسید چرب با COX-2 ایفا می کند. نقش غیر ضروری Arg¹²⁰ (Arg¹⁰⁶ در COX -2) جهت اتصال NSAIDها و اسیدهای چرب در COX -2 احتمالاً به این دلیل است که این ایزوزیم پاکت سیکلواکسیژناز بزرگتری نسبت به COX -1 دارد. این سایز بزرگتر ممکن است به سادگی اجازه دهد تا اسیدهای چرب و مهار کنندگان، محکم‌تر در جایگاه فعال COX-2 متصل شوند که سبب کاهش اهمیت پیوند یونی با Arg¹²⁰ می‌گردد. نتیجه‌ی دیگر جایگاه فعال بزرگتر COX -2 این است که می‌تواند سبب کاهش بار و ازدحام فضایی توسط Arg¹²⁰ در دهانه‌ی این کانال شده و بنابراین سبب افزایش دسترسی و پیوند بیشتر توسط مهار کنندگان غیر اسیدی COX -2 شود. بنابراین Arg¹²⁰ به طور غیر مستقیم در انتخابیت دارو مشارکت دارد از این طریق که مانع برقراری پیوند بین مهار کنندگان غیر اسیدی با جایگاه فعال متراکم COX -1 به نسبت جایگاه فعال بزرگتر COX -2 می گردد. (۴۷)

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۱-۵-۳-۶. بررسی ساختار کریستالی کمپلکس آنزیم COX–1 و مهار کننده
همانطور که اشاره شد فعالیت COX-1 به طور قطعی وابسته به جهت‌گیری مناسب سوبسترای اسید چرب در جایگاه فعال سیکلواکسیژنازی به واسطه‌ی تشکیل پیوند یونی با Arg¹²⁰ می‌باشد. به طوری که اگر آرژنین با اسیدهای آمینه‌ی دیگری با بار مثبت مثل لیزین جایگزین شود،COX-1 کاملاً فعال است.اگر چه جایگزینی با آسپارژین خنثی، آنزیمی با فعالیت کمتر از ۵% و جایگزینی با گلوتامات با بار منفی ایجاد COX -1 گوسفندی غیر فعال و COX -1 انسانی با تنها ۵% فعالیت می کند. به همین ترتیب Arg¹²⁰ جهت برقراری پیوند و در نتیجه مهار توسط مهار کنندگان اسیدی سیکلواکسیژناز که شامل بزرگترین گروه از NSAIDهای غیر انتخابی می‌باشد، ضروری است. ساختارهای کریستالی به دست آمده از COX-1 کمپلکس شده با فلوربی پروفن نشان می‌دهد که، گروه کربوکسیلات این NSAID اسیدی در فاصله‌ی پیوند یونی از Arg120 قرار گرفته است. (۵۵)
جایگزینی Arg¹²⁰ در COX -1 با گلوتامین یا گلوتامات، مهار توسط NSAIDهای اسیدی مثل ایندومتاسین، فلوربی پروفن، کتوپروفن، دیکلوفناک و مکلوفنامات را کاهش داده یااز میان می‌برد.
فلوربیپروفن که COX -1native را از طریق مکانیسم وابسته به زمان مهار می‌کند، COX-1mutant را تنها به صورت رقابتی مهار می کند که اشاره به این نکته دارد که پیوند بخش کربوکسیلیک اسید NSAID جهت تغییرات کونفورماسیونی همراه با مهار وابسته به زمان لازم می‌باشد. نکته‌ی جالب توجه اینکه، مهارکنندگان انتخابی COX-2 غیر اسیدی مثل Dup-697، COXmutant را ده مرتبه قوی‌تر از COX -1native مهار می‌کنند که این پیشنهاد را می‌دهد که Arg120 ممکن است پیوند ممانعت کننده (hinder binding) برای مهار کنندگان غیر اسیدی در COX -1 باشد. نتایج برخی مطالعات پیشنهاد می‌دهد که جایگاه فعال COX -1 دارای یک کانال بلند، باریک و هیدروفوب می‌باشد. در راس جایگاه فعال cox-1 اسید آمینه‌ی Tyr³⁸⁵ قرار دارد. جایگاه عمل آسپرین، Ser⁵³⁰ می‌باشد که تحت اثر آسپرین استیله می‌شود. Ser⁵³⁰ در قسمت زیرین Tyr³⁸⁵ واقع شده است. دهانه‌ی کانال COX -1 شامل بقایای اسید آمینههای قطبی مانند Arg¹²⁰وGlu⁵²⁴ می‌باشد.
۲-۱-۵-۳-۷. بررسی ساختار کریستالی کمپلکس آنزیم COX-2- مهار کننده
مطالعات ساختمان سه بعدی آنزیم COX-2 به صورت کمپلکس شده با مهار کننده‌ها،اطلاعات فراوانی در مورد آنزیم و نحوه‌ی بر هم کنش آن با مهار کننده در اختیار ما قرار می‌دهد. در این باره sc-558 اولین مهار کننده‌ی انتخابی COX-2 بود که ساختار کریستالی آن تعیین گردید.(۵۶)sc-558یک مهار کننده‌ی دی آریل هتروسیکل است که حدود ۱۹۰۰ برابر برای COX-2 نسبت به COX-1 اختصاصی‌تر عمل می‌کند.(شکل ۲-۱۰)

شکل ۲-۱۰. ساختمان مولکولی sc-558
بررسی ساختار کریستالی کمپلکس آن با COX-2 نشان می‌دهد که این ترکیب نیز مانند ایندومتاسین و فلوربی پروفن به جایگاه فعال سیکلواکسیژنازی آنزیم متصل می‌شود. (شکل ۲-۱۱)
شکل ۲-۱۱. ساختار کریستالی کمپلکس COX-1 با فلوربی پروفن و COX-2 باsc-558
حلقه‌ی بروموفنیل این ترکیب، به سمت راس جایگاه فعال COX-2 جهت‌گیری می‌کند، داخل یک حفره‌ی هیدروفوب کوچک می‌شود و با Tyr³⁸⁵،Trp³⁸⁷،Ser⁵³⁰،Phe³⁸¹،Leu³⁸⁴ و زنجیر اصلی Ala⁵²⁷ و Gly⁵²⁶ بر هم کنش هیدروفوب می‌کند. CF3 در موقعیت ۳ حلقه‌ی مرکزی پیرازول نیز داخل پاکت هیدروفوب مجاور آن قرار می‌گیرد که از Met¹¹³،Val¹¹⁶،Val³⁴⁹،Tyr³⁵⁵،Leu³⁵⁹و Leu⁵³¹ تشکیل شده است.CF3 در sc-558 داخل همان حفره‌ای می‌شود که گروه کربوکسیلات فلور بی‌پروفن به آن متصل می‌گردد. کانال در قسمتی که محل اتصال sc-558 است به دو شاخه تبدیل می‌شود. یکی از شاخه‌ها تشکیل حفره‌ای را می‌دهد که پذیرنده‌ی حلقه‌ی برومو فنیل است. حفره‌ی دیگر که در COX-1 قابل دستیابی نیست، حلقه‌ی حاوی گروه سولفونامیدی را در خود جای داده است. حلقه‌ی فنیل آن توسط اسید آمینه‌های هیدروفوبی چون Leu³⁵²،Tyr³⁵⁵،Phe⁵¹⁸،Val⁵²³و زنجیر اصلی Ser³⁵³ احاطه شده است. گروه سولفونامیدی آن به طرف ناحیه‌ای که نزدیک به سطح COX -2 بوده و نسبتاً پلار است امتداد پیدا می‌کند. گروه سولفونامیدی با His⁹⁰،،Gln¹⁹²،Arg⁵¹³ و زنجیر اصلی Ser³⁵³ احاطه شده است. یکی از اتم‌های اکسیژن آن با His⁹⁰ و دیگری با Arg⁵¹³ پیوند هیدروژنی می‌دهد. نیتروژن آمید نیز با اکسیژن کربوکسیلات Phe⁵¹⁸ پیوند هیدروژنی برقرار می‌کند. علت مهم اختصاصی بودن این ترکیب بر هم کنش گروه سولفونامیدی با اسید آمینه‌های مذکور در پاکت جانبی است. این پاکت در COX -1 قابل دستیابی نمی‌باشد و با توجه به اینکه NSAI‌های غیر اختصاصی، جزیی برای بر هم کنش با اسید آمینه‌های این پاکت جانبی ندارند، بااین ایزوفرم(COX-2)کمپلکس پایداری تشکیل نمی‌دهند. تغییر دیگری که نقش مهمی در اختصاصیت این ترکیبات دارد، جایگزینی His513 موجود در COX -1 با آرژنین در COX -2 است. انطباق دو ایزوفرم نشان می‌دهد که حلقه‌ی ایمیدازول در هیستیدین به اندازه‌ی کافی برای بر هم کنش با گروه سولفونامیدی امتداد پیدا نمی‌کند.(۵۶)
۲-۱-۶ .مهار کننده‌های سیکلواکسیژناز
هدف اصلی درمانی داروهای ضدالتهاب غیر استروئیدی (NSAIDs)، فعالیت سیکلواکسیژنازی آنزیم سیکلواکسیژناز می‌باشد. ترکیبات زیادی با ساختارهای شیمیایی متنوع این آنزیم را مهار می‌کنند. NSAIDهایی که دارای مصارف بالینی هستند را می‌توان به چهار گروه تقسیم نمود: (۷ و ۵۷)
مهار کنندگان انتخابی COX-1 (مانند Aspirin با دوز پایین)
مهار کنندگان غیرانتخابی COX (مانند Aspirin با دوز بالا و Indomethacin)
مهار کنندگان ترجیحی COX-2 (مانند Meloxicam)
مهار کنندگان انتخابی COX-2 (مانند Celecoxib)
تقسیم‌بندی فوق براساس تمایل داروی مورد نظر به ایزوفرم‌های آنزیم سیکلواکسیژناز می‌باشد.
۲-۱-۶-۱ .مهار کننده‌های کلاسیک (غیرانتخابی)
این داروها از پرمصرف‌ترین داروها در سراسر جهان می‌باشند و به عنوان داروهای ضد درد، ضدتب و ضدالتهاب مصرف می‌شوند.
۲-۱-۶-۱-۱. طبقه‌بندی ساختمانی مهارکنندگان غیر انتخابی آنزیم سیکلواکسیژناز
این ترکیبات تنوع ساختمانی زیادی دارند ولی به طور کلی می‌توان آنها را در پنج گروه زیر طبقه‌بندی نمود: (۵۶) (شکل۲-۱۲)
سالیسیلات‌ها: (مانند: Aspirin، Salicylamide، Salsalate، Diflunisal)

شکل۲-۱۲. ساختار مشتقات سالیسیلیک اسید
آریل و هتروآریل استیک اسیدها: (مانند: Indomethacin، Sulindac،Tolmetin sodium، Diclofenac sodium Etodolac، Nabumetone) (شکل ۲-۱۳)

شکل ۲-۱۳.ساختار مشتقات آریل و هتروآریل استیک اسید
آریل و هتروآریل پروپیونیک اسیدها: (مانند: Ibuprofen، Fenoprofen calcium، Ketoprofen، Naproxen، Flurbiprofen، Trimethamine،Oxaprozin)(شکل ۲-۱۴)

شکل۲-۱۴. ساختار مشتقات آریل پروپیونیک اسید
N- آریل آنترانیلیک اسیدها (فناماتها: (مانند: Mefenamic acid وMeclofenamate sodium وFlufenamic acid)(شکل ۲-۱۵)

شکل ۲-۱۵. ساختار مشتقات فنامات
مشتقات انولیک اسید (اکسیکام‌ها):(مانند: Piroxicam، Meloxicam)(شکل ۲-۱۶)

شکل ۲-۱۶. ساختار مشتقات انولیک اسید

شکل ۲-۱۷. واکنش انولیزاسیون
۲-۱-۶-۱-۱-۱. سالیسیلات‌ها
استفاده از سالیسیلات‌ها به قرن نوزده بر می‌گردد. سالیسیلیک اسید اولین بار در سال ۱۸۳۸ از سالیسین، گلیکوزیدی که در پوست درخت بید و صنوبر موجود است، به دست آمد. جالب توجه است که Hippocrates در قرن پنجم جویدن پوست بید را جهت رفع درد تجویز می‌کرده است. در سال ۱۸۶۰ سالیسیلیک اسید از سدیم فنوکسید و دی اکسید کربن سنتز شد. زمان اندکی بعد از آن مشتقات سالیسیلیک اسید مورد توجه قرار گرفتند. در سال ۱۸۷۵ سدیم سالیسیلات به عنوان ضد تب- ضد روماتوئید مورد استفاده قرار گرفت. استیل سالیسیلیک اسید در سال ۱۸۵۳ سنتز گردید ولی مصرف بالینی آن تا سال ۱۸۹۹ به تعویق افتاد. تعداد زیادی از مشتقات سالیسیلیک اسید سنتز و از نظر فارماکولوژی ارزیابی شدند ولی تنها تعداد نسبتا اندکی از آنها به مصارف بالینی رسیدند. از مشتقات سالیسیلیک اسید موجود در بازار دارویی می‌توان آسپرین و دیفلو نیزال (با فعالیت ضد التهابی افزایش یافته) را نام برد.
اثرات سالیسیلات‌ها مربوط به توانایی آن در مهار بیوسنتز پروستاگلاندین‌ها می‌باشد. آسپرین تنها NSAID می‌باشد که به طور کووالانسی آنزیم سیکلواکسیژناز را مهار می‌کند.(با استیله کردن Ser⁵³⁰ آنزیم COX-1 و Ser⁵¹⁶ آنزیم COX-2 را مهار می کند. اگر چه آسپرین ۱۰ تا ۱۰۰ برابر جهت مهار COX-1 نسبت به COX-2 قوی‌تر عمل می کند. لازم به ذکر است که سالیسیلات‌ها علاوه بر اثرات ضد تب و ضد درد و ضد التهابی اثرات دیگری نیز دارند که ثابت شده است از نظر درمانی مفید هستند. اخیراً نسبت به توانایی سالیسیلات‌ها جهت مهار تجمع پلاکتی که می‌تواند در ارتباط با حملات قلبی و سکته مهم باشد توجه بیشتری معطوف شده است نقش آسپرین در کاهش مرگ و میر مورد مطالعه قرار گرفته است. آسپرین به صورت برگشت‌ناپذیر COX-1 را در غشای پلاکت‌ها مهار می کند. و این امر منجر به مهار سنتز ترومبوکسان A₂ که فاکتور قوی در تجمع پلاکتی می‌باشد، منجر می‌شود و نهایت سبب کاهش خطر ترومبوزیس می‌شود. مطالعات دیگری بیان می‌کند که آسپرین و سایر NSAIDs می‌توانند در برابر سرطان کولون محافظت کننده باشند. عوارض جانبی سالیسیلات‌ها می‌تواند شامل عوارض گوارشی مثل دیس پپسی،خونریزی معده– دوازدهه باشد. (۱۴)
۲-۱-۶-۱-۱-۲.آریل آلکانوئیک اسیدها
بزرگترین گروه عوامل ضد التهاب غیر استروئیدی،آریل آلکانوئیک اسیدها می‌باشند. آریل آلکانوئیک اسیدها نیز خاصیت مهار بیوسنتز پروستاگلاندین را از طریق مهار COX-1 و COX-2 با درجات مختلف انتخابیت دارا می‌باشند. فاکتورهای چندی سبب گردیده است تا این گروه از ترکیبات، بیشترین کانون توجه در تحقیقات دارویی در سال‌های اخیر باشند. در نتیجه‌ی یک مطالعه در مورد فعالیت ضد التهابی تعدادی از مشتقات ایندول استیک اسید که از لحاظ ساختاری مرتبط با سروتونین و متابولیت‌های آن بودند، marck با مدیریت shen سنتز و فعالیت ضد تب و ضد التهابی قوی‌ترین ترکیب این سری، ایندومتاسین، را در اواسط دهه‌ى ۶۰ گزارش کردند. فعالیت ضد التهابی و ضد تبی ایندومتاسین بسیار بیشتر از فنیل بوتازون بود،این امر انگیزه‌ی قابل توجهی را در سنتز سایر مشتقات آریل و هترو آریل استیک اسید و پروپیونیک اسید ایجاد کرد. به طوری که معرفی ایبوپروفن در دهه ۷۰ بلافاصله با پیدایش فنوپروفن، ناپروکسن و تولمتین دنبال شد. سولینداک آنالوگ ایندومتاسین نیز در اواخر دهه ۷۰ معرفی شد. در دهه ۸۰، زمپیراک، بنوکساپروفن، کتوپروفن، فلوربی پروفن، سوپروفن و دیکلوفناک سدیم تولید شدند. در دهه ۹۰ کتورولاک،اتودولاک، نابومتون به بازار دارویی راه یافتند. البته این پیشرفت سریع با موانعی همراه بود. زمپیراک که در سال ۱۹۸۰ به عنوان ضد درد معرفی شد، در سال ۱۹۸۳ به دلیل واکنش‌های آنافیلاکتیک شدید به ویژه در بیماران حساس به آسپرین کنار گذاشته شد. بنوکساپروفن ۶ ماه بعد از مصرف آن در سال ۱۹۸۲ به دلیل مرگ‌های متعدد ناشی از یرقان کنار گذاشته شد. علاوه بر آن بنوکساپروفن واکنش‌های افزایش حساسیت به نور را ایجاد می‌کند. و همچنین سبب نرم شدن ناخن‌ها در برخی از بیماران می‌شود. سوپروفن که در سال ۱۹۸۵ به عنوان ضد درد معرفی شد دو سال بعد به دلیل ایجاد درد پهلو و نارسایی کلیه از بازار دارویی جمع گردید ولی در سال ۱۹۸۹ جهت مصارف چشمی مجدداً معرفی گشت هم اکنون تعداد زیادی از آریل آلکانوئیک اسیدها در سطوح مختلف آزمون‌های بالینی در حال ارزیابی می‌باشند. (۱۴)
۲-۱-۶-۱-۱-۳ . N– آریل آنترانیلیک اسیدها (فناماتها)