محل نگهداری وشماره هرباریومی

Rindera regia

موسسه جنگل هاو مراتع

Rindera lanata

موسسه جنگل هاو مراتع

Rindera cyclodonta

موسسه جنگل هاو مراتع

Rindera albida

موسسه جنگل هاو مراتع

Rindera bungei

موسسه جنگل هاو مراتع

Rindera media

۳-۴-۱استخراج DNAاز برگ
استخراج DNA کل از سلولهای برگ نمونه های هربایومی صورت گرفت استخراج به روشCTAB
(Doyle,1987& Doyle) انجام گرفت گیاهان این تیره حاوی مقادیر قابل توجهی از متابولیت های ثانویه هستند. به منظوربالا رفتن کیفیت کار بافر استخراج هر روز درست و استفاده می شد.
مراحل استخراج DNA به شرح زیر است:
۱-یک تکه برگ خشک را در هاون اتو کلاو شده می سابیم تا کاملاً پودر شود. (باید توجه داشت که از برگهای زرد، قهوه ای و بیمار استفاده نشود)
۲-به پودر حاصل به نسبت برگ به کار رفته محلول CTAB اضافه می کنیم تا جاییکه محلول یکدست و به رنگ سبز روشن در آید.
۳-۷۰۰میکرولیتر از محلول فوق را درون میکروتیوبهای ۲ میلی لیتری اتو کلاو شده می ریزیم.
۴- زیر هود به هر میکروتیوب ۲۰ میکرولیتر مر کاپتواتانول می افزائیم.
۵- میکروتیوبها را به مدت ۱ الی ۲ ساعت در بن ماری ۶۵ درجه سانتیگراد قرار می دهیم و هر ۵ دقیقه یکبار به دلیل ته نشین شدن مر کاپتواتانول میکروتیوبها را تکان می دهیم.
۶- ۸۰۰ میکرو لیتر کلروفرم – ایزو آمیل الکل با نسبت ۱: ۲۴ به میکروتیوبها اضافه کردیم و سپس آنها را به مدت ۲۰ دقیقه با دست تکان دادیم.
۷- میکروتیوبها را به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت ۱۱۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۸- در این مرحله ۳ فاز تشکیل می شود فاز بالایی حاوی DNA است برای اینکه با فاز پائینی مخلوط نشودDNAرا برداشته و به میکروتیوب استریل دیگری منتقل می کنیم.

۹-و باز دوباره کلروفرم و ایزوآمیل الکل به حجم ۸۰۰ میکرو لیتر به آن اضافه می کنیم و باز دوباره میکروتیوبها را به مدت ۱۰ الی ۲۰ دقیقه با دست تکان می دهیم باز سانتریفیوژ به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت ۱۱۰۰۰ دور.
۱۰- میکروتیوبها از سانتریفیوژ خارج کرده و ۲۰۰ میکرو لیتر از فاز بالایی می کشیم و به میکروتیوبهای جدید انتقال می دهیم.
۱۱- ۷۰۰ میکرو لیتر ایزوپروپانول اضافه می کنیم و در دمای منفی ۲۰ درجه به مدت۲ الی ۲۴ ساعت می گذاریم.
۱۲- میکروتیوبها را از یخچال در آورده و با سرعت ۸۰۰۰ دور در ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ می کنیم.
۱۳ –بلافاصله محلول رویی را دور ریخته و اتانول ۷۰% سرد را به مقدار ۲۰۰ میکرولیتر به رسوب DNA اضافه می کنیم.
۱۴- میکروتیوبها را به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۸۰۰۰سانتریفیوژ می کنیم.