%۱۴.۴

Glycin

۳-۱۳- آماده سازی الکتروفورز عمودی
بافر تانک در دو قسمت بالایی و پایینی صفحات شیشه ای حاوی ژل جداکننده و متراکم کننده برای برقراری جریان در ژل ریخته شد.کابل های برقراری جریان در دو قطب،از قطب منفی به قطب مثبت اتصال یافت.سیستم خنک کننده نیز برای جلوگیری از گرم شدن بافرها و خراب شدن نمونه های پروتئینی وصل شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۱۳-۱ آماده سازی پروتئین
رسوب هر کدام از باکتری های گرفته شده در هر ۵ ساعت متوالی با ۲۰۰ میکرولیتر بافر بارگذاری پروتئین مخلوط شد، و در دمای ۱۰۰ درجه ی سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه جهت لیز شدن باکتریها و آزاد شدن و دناتوره شدن پروتئینها جوشانده شد. .
۳-۱۳-۲ بارگذاری پروتئین
مخلوط پروتئین-بافر نمونه گذاری جوشیده شده،با سرنگ همیلتون با دقت در چاهک های مشخص شده بارگذاری شد.سایز مارکر پروتئین(فرمنتاز)^[۴۷] نیز پس از جوشیدن در ۱۰۰ درجه سانتی گراد به مدت ۳ دقیقه در چاهک جداگانه و در کنار نمونه های پروتئینی برای تعیین اندازه پروتئین، بارگذاری گردید. با توجه به (شکل ۳-۱)پس از بارگذاری نمونه ها،و روشن نمودن دستگاه الکتروفورز،نمونه های پروتئینی در ولتاز۱۰۰ و در ۵۰ میلی آمپر به مدت۶ ساعت،الکتروفورز شد.
(شکل۳-۱)الکتروفورز نمونه های پروتئینی
۳-۱۴- رنگ آمیزی ژلSDS-PAGE
۳-۱۴-۱ ساخت محلول رنگ
روش های گوناگونی برای رنگ آمیزی ژل SDS-PAGE وجود دارد.اما روشی که در این کار مورد استفاده قرار گرفت،روش سریع و ساده رنگ آمیزی با کوماسی بلو و نیترات نقره است.برای آماده سازی محلول رنگ کوماسی بلو،۴۰۰ میلی گرم پودر رنگ کوماسی بلو G-250 با ۴۰ میلی لیتر پرکلریدریک اسید ۷۲% مخلوط شد و با آب مقطر حجم آن به ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانده شد.سپس محلول رنگ در انکوباتور شیکردار به مدت یک ساعت قرار داده شد.پس از آماده شدن محلول رنگ،با کاغذ صافی،صاف شد و آماده استفاده شد.
۳-۱۴-۲ نحوه رنگ آمیزی
پس از اتمام الکتروفورز، صفحات شیشه ای باز شد و ژل با احتیاط برداشته شد و در محلول رنگ کوماسی بلو قرار داده شد.محلول رنگ و ژل در ظرف شیشه ای پیرکس،در داخل مایکروویو با توان ۱۰۰ وات به مدت ۵ دقیقه گذاشته شد.سپس محلول خارج شدو در ظرف مخصوص خود برای استفاده در دفعات بعدی رنگ آمیزی ریخته شد.روی ژل با آب مقطر پوشانیده شد و مجددا در مایکرویو با همان توان ۱۰۰ وات به مدت ۵ دقیقه گذاشته شد.سپس آب مقطر دور ریخته شد.این کار تا زمان ظاهر شدن باندهای پروتئینی تکرار شد.قابل ذکر است در این روش باندهای پروتئینی در ۵ دقیقه دوم بخوبی قابل تفکیک هستند.
پس از ظاهر شدن باندهای پروتئین، وجود و اندازه پروتئین مورد نظر با سایز مارکر پروتئین مشخص گردید.
رنگ امیزی با نیترات نقره:

• ژل در ظرف حاوی ۱۰۰میلی لیتر الکل ۱۰% و ۵۰۰ میکرولیتر اسید استیک غوطه ور شده و ۳ دقیقه به آرامی همزده شد سپس محلول دور ریخته شد.

• تکرار مرحله قبل یکبار دیگر

• ۲/۰ گرم نیترات نقره را باآب مقطر به حجم۱۰۰میلی لیتر رسانده و پس از حل کردن، بر روی ژل ریخته شد و ۱۵ دقیقه بر روی شیکر با دور آرام قرار گرفت.

• خارج کردن نیترات نقره و دوبار شستشو با آب مقطر انجام شد.

• دو گرم سود را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد و ۱میلی لیتر فرمالدئید به آن اضافه گردید و ژل در آن قرار گرفت و ۱۵ دقیقه بر روی شیکر با دور آرام قرار داده شد.

• باید در این حالت باندها مشاهده گردد.

۳-۱۵- خالص سازی پروتئین نو تر کیب در E.coli
داخل یک ارلن ۵۰ سی سی مقدار ۱۰ سی سی محیط کشت ال بی براث استریل حاوی امپی سیلین ریخته شد بعد ۶تا ۷ کلنی از پلیت porA تازه کشت شده ۱۶ ساعته به آن تلقیح گردید و روی شیکر انکوباتور با دمای ۳۷ درجه و دور rpm170 به مدت ۱۶ ساعت قرار گرفت. در نهایت محیط کاملا کدر حاصل شد.
مقدار ۱۰۰ سی سی از محیط کشت ال بی براث استریل حاوی امپی سیلین در هر یک از دو ارلن cc500 ریخته شد، سپس از محیط کشت ۱۶ساعته که کاملا کدر است ۵سی سی به هر کدام از دو ارلن اضافه گردید بعد از آن به مدت ۲ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۷درجه با دور rpm170 قرار گرفت تا OD آن بین ۸/۰ تا ۱شود سپس به آن IPTG اضافه شد (به ازای هر ۱میلی لیتر محیط کشت به ان ۲ میکرولیتر IPTG اضافه شد) .داخل شیکر انکوباتور به مدت ۵ساعت قرار گرفت و سپس هر کدام از ۱۰۰میلی لیتر با سانتریفیوژ یخچال دار در دمای ۴ درجه سانتیگراد با دور rpm4000 سانتریفیوژ شد و محلول رویی کامل تا قطره آخر کشیده و دور ریخته شد،در نهایت سلول ها نگهداری شد.
۳-۱۶- شکستن سلولها برای ازاد سازی پروتئین
ابتدا سلولها ی بدست آمده از مرحله ی بالا در ۴میلی لیتر بافر لیز کننده^[۴۸] کاملا سوسپانسیون شد تا رسوب کاملا حل شود سپس ۵۰ میکرولیتر لیزوزیم به آن اضافه گردید (برای شکستن دیواره سلولی ) و به مدت ۳۰ دقیقه روی یخ قرار گرفت سپس هر دو سه دقیقه یکبار اینورت گردید.بعد از آن ۴۰ میکرولیتر تریتون X100 به آن اضافه و به آرامی مخلوط شد و در داخل یخچال به مدت ده دقیقه قرار گرفت و هر یک دقیقه یکبار آرام آرام داخل یخچال هم زده شد پس از آن با سانتریفوژ یخچال دار در دمای ۴ درجه سانتیگراد با دور rpm4000 سانتریفیوژ گردید و محلول رویی برای خالص سازی نگهداری شد.(حاوی پروتئین آزاد شده است).
۳-۱۷- خالص سازی با ستون نیکل سفاروز
بصورت دستی با یک سرنگ ۵میلی لیتر ستون نیکل-سفاروز ایجاد شد. بدین ترتیب که روی پایه، یک سرنگ ۵میلی لیتر بسته شد و ته سرنگ با پشم شیشه پوشانده شدسپس داخل سرنگ ۲میلی لیتر نیکل سفاروز ریخته شد تا ته نشین یا پک شود. سپس از بالای ستون یک میلی لیتر محلول واشینگ ریخته شد تا ژل شستشو یابد. وقتی محلول واشینگ از ستون خارج شد از بالای ستون نمونه ی پروتئین ریخته شد و تا خروج کامل همه ی نمونه پروتئین از ستون زمان داده شد .سپس ۱۰میلی لیتر محلول شستشو دهنده ریخته شد تا پروتئین های اضافه را شستشو داده و خارج شود و فقط پروتئین با توالی هیستونی که مد نظر است و به ژل نیکل سفاروز باند شده بماند. بعد میزان ۷ میلی لیتر الوشن^[۴۹] از بالای ستون اضافه گردید و آن را از انتهای ستون به مقدار ۱میلی لیتر در هر یک از هفت میکروتیوب جمع آوری شد. پروتئین مورد نظر در این مرحله از ژل جدا گردید که این همان خالص سازی مد نظر است. سپس ۲۸۰OD: برای هر کدام از هفت میکروتیوب خوانده شد.میزان جذب بدست آمده باید از حداقل به حداکثر پیش رود و در انتها دوباره کاهش پیدا کند. سپس برای آنهایی که جذب بالایی دارند SDS-PAGE گذاشته شد که باید یک باند تک مشاهده گردد. برای نمونه هایی که جذب بالا دارند برد فورد مورد سنجش قرار گرفت.
۳-۱۷-۱ مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی
Stock solution A (10X)

NaCL

NaH2PO4

۵M

۲۰۰mM

برای حجم ۵۰ میلی لیتر PH=3.6
Stock solution B (10X)