1. 1. پودر آگارز

1. 1. بافر۵۰X TAE

1. 1. Tris یک مولار

1. 1. اسید استیک گلاسیال

1. 1. EDTA نیم مولار

1. 1. رنگ اتیدیوم برماید شرکت آواژن

1. 1. بافر سنگین کننده ^[۱۰۶]X 6 شرکت سیناژن

برای الکتروفورز محصولات آزمون زنجیره ای پلی مراز، ابتدا نیاز به ساخت بافر TAE است. این بافر به صورت X50) مخژن) تهیه می گردد. به طور خلاصه برای تهیه آن، ابتدا ۲۴ گرم Tris-base را با ۷/۵ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال و ۱۰ میلی لیتر محلول نیم میلی مولار EDTA (PH=8) محلوط کرده و سپس حجم محلول را با آب مقطر به ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم. برای تهیه ژل آگاروز و همچنین استفاده در تانک الکتروفورز، بایستی از محلول TAE1X استفاده کنیم بطوریکه یک میلی لیتر از محلول ۵۰X برداشته و با ۴۹ میلی لیتر آب مقطر مخلوط کرده و مورد استفاده قرار می دهیم.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

جهت تهیه ژل آگاروز ۱.۵ درصد، ۱.۵ گرم آگاروز( شرکت Eurx، لهستان) را با ۱۰۰ میلی لیتر از بافر TAE 1X را داخل ارلن مخلوط کرده و بر روی شعله قرار داده و می جوشانیم. سپس پس از کمی سرد شدن، آنرا به داخل کاست حاوی شانه می افزاییم. پس از حدود نیم ساعت، ژل مورد نظر سفت شده و شانه را به آهستگی خارج می کنیم و ژل را در داخل تانک حاوی بافر TAE 1 X قرار می دهیم. سپس سه میکرولیتر از هر محصول PCR را با ۱.۵ میکرولیتر بافر سنگین کننده ( شرکت سیناژن، ایران) مخلوط می کنیم و به داخل چاهک هایی که شانه ایجاد نموده، می افزاییم. همچنین برای تعیین اندازه محصولات PCR یا آمپلیکون ها، در چاهک اول ژل، مارکر ۱۰۰bp plus( شرکت Invitrogen، آلمان) را اضافه می کنیم. سپس الکتروفورز به مدت یک ساعت در ولتاژ ۸۰ ولت انجام می گیرد. پس از اتمام الکتروفورز، ژل را از تانک خارج کرده و در داخل تانک حاوی محلول اتیدیوم برماید به مدت ۱۵ دقیقه قرار داده و سپس ژل در داخل تانک حاوی آب مقطر به مدت همان ۱۵ دقیقه قرار می دهیم. سپس ژل را از داخل تانک خارج کرده و در دستگاه ترانس ایلومیناتور( شرکت بایورد، آمریکا) در زیر نور ماورای بنفش از نظر وجود بند محصول PCR بررسی نموده و از آن عکس می گیریم.
۳-۴-۳- محاسبه ی اندازه و تعداد تکرار های VNTR
تعداد تکرار در هر لوکوس VNTR را می‌توان به راحتی پس از انجام PCR و تفکیک محصول PCR (امپلیکون) با بهره گرفتن از الکتروفورز بر روی ژل آگارز، محاسبه نمود. اگر اندازه امپلیکون یا همان محصول PCR را از مجموع مناطق دربرگیرنده چپ و راست^[۱۰۷] کم نماییم و عدد حاصل را بر اندازه تکرار^[۱۰۸] (که از قبل، توسط مقاله یا پروتوکل استاندارد در اختیار ما قرار داده شده است) تقسیم کنیم، تعداد تکرار^[۱۰۹] در هر لوکوس محاسبه می‌شود. علاوه بر این، برای محاسبه دقیق اندازه آمپلیکون‌ها بایستی حداقل از دو یا سه ستون سایز مارکر استفاده شود بطوریکه یکی در آخرین ستون سمت چپ، یکی در آخرین ستون سمت راست و دیگری در ستون وسط ژل قرار داده شود. در این مطالعه از سایز مارکرهای ۱۰۰ bp plus (شرکت Invitrogen، آلمان) استفاده گردید.برای آنکه بتوان باند های کوچک را خواند باید از سایز مارکر۵۰bp plus استفاده نمود. در صورت عدم تکثیر محصول VNTR، یکبار دیگر PCR برای ایزوله مزبور تکرار می‌گردد. در صورتی که بازهم هیچگونه تکثیری مشاهده نشد، الل مزبور به صورت تُهی (null) در نظر گرفته می‌شود. این امر ممکن است واقعاً به دلیل عدم وجود لوکوس VNTR و یا موتاسیون در جایگاه اتصال پرایمرها اتفاق افتاده باشد که به هر حال منجر به عدم تکثیر لوکوس VNTR خواهد شد. در ضمن، الل‌هایی که تعداد تکرار آن‌ها دارای عدد اعشاری بود، به نزدیک‌ترین عدد صحیح، گرد شدند (۲۷).
۳-۴-۴-تجزیه و تحلیل داده های VNTR
تعداد تکرارهای حاصل برای هر لوکوس در هر ایزوله محاسبه گردید که به همراه سایر مشخصات ایزوله‌ها (مانند سرگروه‌ها و غیره) وارد نرم افزار Microsoft Excel 2003 شد و سپس با بهره گرفتن از نرم افزار موجود در سایت www.mlvaplus.net، این داده‌ها به شکل آنالیز MST^[110] به نمایش گذاشته شد. تعداد الل‌های متفاوت مشاهده شده و همچنین الل غالب در هر لوکوس تعیین گردید. علاوه بر این، در هر لوکوس، ضریب تنوع سیمپسون^[۱۱۱] در مورد هر لوکوس VNTR جهت تعیین قدرت تفکیک و تمایز^[۱۱۲] محاسبه گردید. فرمول ضریب تنوع سیمپسون به صورت زیر می‌باشد:
۱-∑ [n_j (n_j-1)] /
در این فرمول، N برابر با تعداد کل ایزوله‌ها و n_j برابر با تعداد ایزوله‌های متعلق به هر ژنوتیپ است. علاوه بر این، داده‌های VNTR به کمک همان نرم افزار موجود در سایت ww.mlvaplus.net، جهت ترسیم دندروگرام (درختچه فیلوژنتیکی) با بهره گرفتن از روش UPGMA^[113] و ضریب تشابه Dice^[114] نیز مورد آنالیز قرار گرفتند (۲۷ و۷).

یافته ها
۴-۱- نتایج حاصل از جمع آوری نمونه ها
نمونه های بالینی مربوط به سالمونلا از بیمارستان ها و آزمایشگاه های مختلف در شهر تهران جمع آوری گردید. ۱۳۸ ایزوله ی سالمونلا جداسازی و مورد مطالعه قرار گرفتند. درضد بالایی( ۸۰%) از بیماران مراجعه کننده به مرکز طبی کودکان جداسازی شدند. از نظر توزیع نمونه ها قابل ذکر است که درصد بالایی( ۸۷%) از نمونه ها مدفوعی بقیه مربوط به خون، ادرار و مایع مفصلی شانه بودند.
جنسیت ۵۲ نفر ( ۳۷%) از بیماران مذکر و ۴۶ نفر( ۳۳%) مونث بود و جنسیت مابقی( ۳۰%) ثبت نشده بود. در مطالعات قبلی که توسط استاد راهنمای این تحقیق و سایر همکاران انجام شد میزان فراوانی سروتایپ های سالمونلا به صورت زیر بود:
۵۱ ایزوله مربوط به سروتایپ انتریتیدیس( Enteritidis)، ۴۳ ایزوله متعلق به سروتایپ اینفنتیس ( Infantis)، ۲۴ ایزوله متعلق به سروتایپ تایفی موریوم( Typhi murium)، ۴ ایزوله متعلق به سروتایپ آلبانی( Albany)، ۳ ایزوله متعلق به سروتایپ مونچن( Muenchen)، ۲ ایزوله متعلق به سروتایپ ریچموند( Richmond)، ۲ ایزوله متعلق به سروتایپ نیوپورت( Newport)، ۲ ایزوله متعلق به سروتایپ هادار( Hadar)، ۲ ایزوله متعلق به سروتایپ هاوانا( Havana)، ۱ ایزوله متعلق به سروتایپ پاراتایفی B( Paratyphi B)، ۱ ایزوله متعلق به سروتایپ هایفا( Haifa)، ۱ ایزوله متعلق به سروتایپ ردینگ( Reading)، ۱ ایزوله متعلق به سروتایپ کنتاکی( Kentucky) و یک ایزوله متعلق به سروتایپ اریون( Orion) بودند.
از آنجا که میزان شیوع سروتایپ انتریتیدیس از سایر سروتایپ ها بالاتر بود، از آن جهت انجام این تحقیق استفاده نمودیم.
نمودار ۴-۱، میزان فراوانی هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر
نمودار ۴-۲، میزان شیوع هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر
۴-۲- نتایچ حاصل از استخراج ژنوم باکتریایی
با بهره گرفتن از دستگاه اسکپتوفوتومتر، در طول موج های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر، به ترتیب میزان جذب DNA، پروتیین و تعیین میزان خلوص DNA انجام می گیرد.
شکل ۴-۱، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی ۵۳
شکل ۴-۲، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی ۲۴
۴-۳- نتایج حاصل از واکنش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR
ژنوتایپینگ با بهره گرفتن از تکنیک MLVA و با کمک واکنش PCR بر روی ۵۱ ایزوله ی سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس صورت گرفت. در تصاویر زیر چند ژل الکتروفورز محصولات VNTR و تنوع در تعداد تکرار های هر یک از آنها به عنوان مثال نمایش داده شده است. پس از انجام الکتروفورز، اندازه ی باند ها را به تعداد تکرار تبدیل کرده و در فایل EXCEL® ثبت گردید.
شکل ۴-۳، تصویری از ژل الکتروفورز محصولات VNTR در برخی سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوس ENTR6 مشخص است. اعداد بالای محصولات لوکوس های VNTR بیانگر تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر ۱۰۰bp استفاده شده است.
شکل ۴-۴، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوس SE4 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۵، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سوی های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوس SE4 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۶، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSE6 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۷، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوس SE6 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۸، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSE7 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۹، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSE7 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۰، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSE8 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۱، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSE8 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۲، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSE10 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۳، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSE10 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۴، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSENTR2 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۵، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSENTR2 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۶، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSENTR3 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
شکل ۴-۱۷، تصویری از ژل محصولات VNTR در برخی از سویه های نماینده. در این ژل به خوبی، تنوع اندازه ی محصولات مختلف VNTR مربوط به لوکوسSENTR3 مشخص است. اعداد بالای محصولات VNTR، بیانگر تعداد تعداد تکرار می باشد. در این ژل از مارکر۱۰۰bp استفاده شد.
جدول ۴-۱، در جدول زیر فایل EXCEL را مشاهده می کنید که تعداد تکرار هر لوکوس VNTR در هر نمونه در آن ثبت شده است.