شکل ۴-۱۰. نقشه ژنی پلاسمید pet-28a
این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین تشکیل کلونی می دهد. در شکل ۴-۱۱ کلونی های رشد کرده بر روی محیط کشت حاوی انتی بیوتیک کانامایسین بعد از ترانسفورماسیون باکتری BL21(DE3) با پلاسمید pet-28a حاوی ژن ناحیه Vرا نشان می دهد.
شکل ۴-۱۱باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن ناحیه V بروی محیط حاوی انتی بیوتیک کانامایسین
سپس از تک کلونی های رشد کرده استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی صورت گرفت تا وجود پلاسمید حاوی ژن مورد نظر تائید شده و از طرفی وجود هرگونه الودگی را از بین ببرد. برای تائید وجود پلاسمید pet-28a در محصول استخراج پلاسمید، الکتروفورز صورت گرفت و با تشکیل باند در bp6031 ، این ادعا تحقق یافت. در شکل ۴-۱۲ ، نتیجه الکتروفورز محصول استخراج پلاسمید pet-28a از سلول های ترانسفورم شده BL21(DE3)، نشان داده شده است.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

شکل ۴-۱۲. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه Vدر باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)- از سمت راست چاهک اول نمونه حاوی پلاسمد Pet-28a حاوی ناحیه V و چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1KB .پیکان قرمز باندbp 6031 مربوط به pet حاوی ناحیه V و پیکان ابی محل باندbp 6000 لدر.
پس از این که وجود پلاسمید pet-28a در محصول حاصل از استخراج پلاسمید کلونی های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن سنتز شده ناحیه V تائید شد، به کمک تکنیک هضم دوگانه انزیمی، وجود ژن ناحیه Vدر پلاسمید، با توجه به جایگاه های انزیمی NcoIو XhoIقرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. دو باند مورد نظر bp662 ( ژن ناحیه V) و bp5369 ( پلاسمید pet-28a ) نمایان گشت که تائیدی بر وجود ژن ناحیه مورد نظر در باکتری ترانسفورم شده است. شکل ۴-۱۳ نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه V پروتئین ALCAMرا نشان می دهد.
شکل ۴-۱۳نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه V-چاهک اول از سمت راست لدر DNA1kb و چاهک های دوم سوم و چهارم نمونه هضم انزیمی pet حاوی ناحیه v –پیکان های قرمز از بالا باندهای ۶۰۰۰ وbp 500 لدر و پیکان های ابی از بالا باند ۵۳۹۶ ((pet28 و هم چنین bp622 ناحیه V
۴-۵ بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM و تائید ان به کمک تکنیک SDS-page
در باکتری میزبان،با توجه به وجود V پس از تائید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن ناحیه
در رقت منا سب IPTG ،جهت القا بیان پروتئین در باکتری از القاگر Pet در پلاسمید Lac پروموتر
استفاده گردید.جهت جدا سازی باند های پروتئینی سلولی و به منظور ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین مورد نظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل الکتروفورز گردید.پس از رنگ SDS-page امید استفاده و عصاره های سلولی تهیه شده بر روی
امیزی با محلول رنگ امیزی باند ۲۳ کیلو دالتونی مربوط به پروتئین ناحیه سنتز شده ظاهر گردید در صورتی که در ناحیه مشاهده شده باند مزبور هیچ گونه باندی بروی نمونه منفی مشاهده نگردید.در شکل۴-۱۴ باند مربوط به پروتئین مورد نظر بروی ژل اکریل امید۱۵ درصد قابل مشاهده می باشد.
شکل ۴-۱۴. بررسی بیان پروتئین ناحیه Vبه کمک تکنیک SDS-page- از سمت راست چاهک اول نمونه کنترل مثبت حاوی پروتئین بیان شده ناحیه V –چاهک دوم لدر پروتئینی و چاهک سوم نمونه کنترل منفی-پیکان قرمز رنگ باند ۲۳ کیلو دالتونی پروتئین ناحیه V و پیکان سبز باند ۲۵ کیلو دالتونی لدر پروتئینی
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
بحث:
همانطور که بیان شد ALCAM به عنوان مارکرسلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است.سلول های بنیادی سرطان زیرمجموعه کوچکی از سلول های سرطانی اند که توانایی منحصر به فردی در خود تجدیدی دارند.(یوسوکه شینوزاوا و همکاران،۲۰۱۳)کارامدی و موفقیت درمان سرطان در مرحله ی اول با میزان بریدن توده تومور سنجیده می شود. اما سلول های بنیادی سرطان می توانند بخش خیلی کوچکی از بقایای تومور را تشکیل دهند و با فعالیت خود تومور جدیدی بسازند. روش های متداول شیمی درمانی سلول ها تمایز یافته یا درحال تمایز را که قسمت عمده ی توده تومور را شکل می دهند هدف قرار می دهند اما باید توجه داشت که این سلول ها تنها حجم تومور را می سازند و قادر به تولید سلول های جدید نیستند و در پیشرفت بیماری و رشد تومور نقشی ندارند در حالی که جمعیت سلول های سرطانی که سرطان و رشد تومور را سبب می شوند، دست نخورده و دور از چشم باقی مانده و باعث عود کردن بیماری می شوند.برخی محققان بر این باورند که در مرکز هر توموری تعداد کمی سلول های بنیادی نابهنجار قرار گرفته اند که رشد بافت های بدخیم و ناهنجار را تداوم می بخشند.اگر این نظر درست باشد، می تواند توضیح دهد که چرا تومورها اغلب حتی پس از اینکه به وسیله داروهای ضد سرطان تقریباً تخریب شده اند دوباره بازسازی می شوند. این حالت همچنین یک راهکار متفاوت برای ایجاد داروهای ضد سرطان را نشان می دهد و دال بر آن است که این داروها می بایستی برای از بین بردن سلول های بنیادی سرطانی و نه برای توانایی شان در از بین بردن هر سلولی و کوچک کردن تومورها، انتخاب شوند.
طبق گزارشات صورت گرفته بیش از ۹۰% مرگ و میرهای سرطانی به دلیل متاستاز رخ می دهند .تومورهای اولیه می توانند توسط جراحی یا درمان های مکمل شیمیایی به خوبی درمان شوند، اما سرطان هایی که به مرحله متاستاز رسیده اندبه درمان مقاوم اند. این خصوصیت مقاومت، دلیل فراوانی مرگ رادرمیان افراد دارای متاستاز نشان می دهد. بنابراین درمان موثر سرطان وابستگی زیادی به شناخت کامل فرایند های ایجادکننده متا ستاز وفراهم کردن راهکارهایی برای مقابله با این پدیده دارد. متاستاز به مفهوم رشد، تکثیر و تهاجم سلولهای توموری در مکانهای متفاوت بدن می باشد)محمدرضا نوری دلویی و همکاران ،۱۳۹۱).هم چنین یکی از معظلات اسا سی که برای سرطان کولورکتال در نظر گرفته شده است متاستاز ان به خصوص به بافت های کبد و ریه می باشد.
از طرفی مارکرهای سلول های بنیادی سرطان را می توان برای اهدافی نظیر تشخیص،پیش بینی پا سخ به درمان و درمان مورد استفاده قرار داد(دومنیکو ریباتی،۲۰۱۲)..بنابراین ما در این تحقیق ناحیه VپروتئینALCAM را که به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان کولورکتال معرفی شده است و هم چنین در مراحل مختلف از پیشرفت سرطان کولورکتال بیان دارد و به عنوان یک هدف بالقوه درمانی برای سرطان کولورکتال معرفی شده است را، ابتدا با بهره گرفتن از علم بیوانفورماتیک در راستای بهترین بیان ارزیابی کرده و سپس در میزبان مناسب کلون کرده و در نهایت پروتئن مورد نظر را بیان کردیم.
با پیشرفت علم ژنتیک، ژن به عنوان فاکتور اصلی در برنامه‌ریزی عملکرد سلول و به دنبال آن کنترل ویژگی‌های موجود زنده شناخته شد. به این ترتیب تمایل برای شناخت هرچه بیشتر ژن‌ها به منظور توجیه پدیده‌های زیستی و بهبود زندگی انسان به عنوان پیچیده‌ترین موجود، به طرز چشمگیری افزایش یافت؛ تا حدی که در چند دهه اخیر، تجهیرات مورد نیاز در تحقیقات مولکولی به طور گسترده‌ای افزایش یافته است و امروزه تحقیقات مولکولی جزو مطالعات رایج آزمایشگاه‌های زیستی است.
با این وجود استفاده از این حجم وسیع اطلاعات پردازش نشده نمی‌توانست چندان مفید باشد. در این زمان با پیشرفت چشم‌گیر تکنولوژی اطلاعات و کاربرد آن در زمینه‌های مختلف، به نظر رسید که ادغام این دو علم می‌تواند راه‌ گشا باشد. به این ترتیب، حدود اوایل سال ۱۹۷۵ بود که رشته‌ بیوانفورماتیک با هدف استفاده از تکنیک‌ های مدیریت سیستم‌های «داده» در مطالعات بیولوژیک شکل گرفت. با پیشرفت بیوانفورماتیک دخالت سایر رشته‌ ها در پیشبردِ کار امری اجتناب ناپذیر بود. حجم بالای اطلاعات و پردازش آ‌‌‌ن‌ها وجود کامپیوترهای پیشرفته‌ تر را می‌طلبید. تحلیل داده‌ها و نتیجه گیری منطقی از آن‌ها حضور علم آمار را در این رشته رقم زد. به این ترتیب علم بیوانفورماتیک به عنوان یک تخصص میان‌رشته‌ای با ادغام زیست شنا سی، ریاضیات (بویژه آمار)، علوم کامپیوتر و تکنولوژی اطلاعات ایجاد شد
زیست‌داده‌ورزی یا بیوانفورماتیک دانش استفاده از علوم کامپیوتر و آمار و احتمالات در شاخه زیست شناسی مولکولی است. این دانش نوظهور، به عنوان یک دانش بین رشته‌ای، تلاش می‌کند تا با بهره گرفتن از تکنیک‌های موجود در علوم کامپیوتر، ریاضیات، شیمی، فیزیک و علوم مرتبط دیگر، مسایل مختلف زیست‌ شنا ختی را که معمولاً در سطح مولکولی هستند حل کند.
اطلاعات به دست آمده از تحلیل داده‌های زیستی توسط علم بیوانفورماتیک، در موارد زیر به زیست شناسی کمک می‌کند:
یافتن ژن‌ها در میان توالی‌های ژنومیک
به خط کردن توالی‌ها در بانک‌های اطلاعاتی برای یافتن شباهت‌ها و تفاوت‌ها
پیش‌گویی ساختار و عملکرد محصولات ژن‌ها
توضیح تعامل ژن‌ با محصولاتش
یافتن ارتباط فیلوژنتیک میان ژن‌ها و توالی‌های پروتئینی
مشهورترین کاربرد بیوانفورماتیک در تحلیل توالی هاست توالی های DNA مربوط به ارگانیزم های مختلف جهت دستیابی سریع و مقایسه آنها با یکدیگر ، در پایگاه های داده ذخیره می شوند. در این مطالعه از علم بیوانفورماتیک جهت پیش بینی و بالا بردن دقت در سنتز ژن ناحیه مورد نظراستفاده شد. یکی از کاربرد های بیوانفورماتیک بهینه سازی ژن نوترکیب با توجه به میزبان می باشد که در ان رایانه با بهره گرفتن از داده های پیش فرض و پارامتر های دخیل در سیستم رونویسی مثل کدون های بهینه، درصد اسیدامینه های گوانین و سیتوزین توالی و …، بهترین توالی ممکن برای ژن نوترکیب جهت بیان در میزبانی مشخص را پیشنهاد می دهد. این عمل موجب ان می شود که میزان و دقت بیان ژن طراحی شده در میزبان انتخابی بالا رود.
جهت بیان یک ژن نوترکیب لازم است که این ژن را درون یک میزبان مناسب کلون کنیم. کلون سازی ژن می تواند یک نمونه خالص از یک ژن منفرد را ایجاد کند. این ژن از همه ژن های دیگری که در حالت عادی در سلول وجود دارند، متمایز است. ( براون، ۱۹۹۵)
کلونینگ ژن به روش‌های مختلفی صورت می‌گیرد اما اساس همه‌ی آنها به این صورت است که DNA هدف از سلول دهنده استخراج می‌شود و با کمک آنزیم‌هایی برش داده می‌شود و به داخل یک مولکولDNA حلقوی، که معمولاً یک پلاسمید است و نقش ناقل ( وکتور ) را دارد، وارد می‌شود. به این ترتیب یک مولکول DNAنوترکیب ساخته می‌شود. در مرحله‌ی بعد DNA نوترکیب را به سلول میزبان که اغلب نوعی باکتری می‌باشد منتقل می‌کنند. این مرحله را ترنسفورماسیون می‌نامند. DNA نوترکیب در سلول میزبان همانند سازی می‌کند و همراه سلول میزبان تکثیر می‌شود. سلول‌های حاصل از تقسیم سلول میزبان اولیه، نسخه ‌هایی ازDNA نوترکیب همانند سازی شده را به ارث می‌برند. سلول‌ های باکتری به دنبال تقسیمات متعدد کلنی تشکیل می ‌دهند و از آنجا که اعضای این کلونی حاوی یک یا چند نسخه از ژن مورد نظر ما که در DNA نوترکیب حمل می‌شود می‌باشد، می‌توان گفت این ژن کلون شده است.
همان گونه که توضیح داده شد برای انتقال قطعه ژن نوترکیب به میزبان نیاز به حامل یا وکتور داریم. برای اینکه یک مولکول DNAبتواند به عنوان یک حامل کلون سازی عمل کند باید ویژگی های متعددی را دارا باشد. از همه مهم تر این که باید بتواند درون سلول میزبان همانند سازی کند تا به این ترتیب کپی های بسیاری از مولکول های DNA نوترکیب تولید شده و به سلول های دختر منتقل شود. همچنین یک حامل باید نسبتا کوچک باشد، به طور ایده ال کمتر از kb10 ، چرا که مولکول های بزرگ اغلب در تخلیص می شکنند و کار کردن با ان ها نیز بسیار مشکل است. از معدود مولکول‌های DNAای که این ویژگی‌ها را دارا می‌باشند، .پلاسمید ها هستند.پلاسمید ها مولکول های DNA حلقوی هستند که بطور مستقل در سلول های باکتریایی حضور دارند. پلاسمید ها تقریبا همیشه یک یا تعدادی ژن را حمل می کنند و معمولا این ژن ها یک شاخص مفید هستند که توسط باکتری میزبان نشان داده می شوند. برای مثال توانایی زنده ماندن در غلظت های سمی انتی بیوتیک ها مثل امپی سیلین یا کانامایسین، اغلب مربوط به حضور یک پلاسمید در باکتری است که ژن های مقاومت در برابر انتی بیوتیک را حمل می کنند. در ازمایشگاه، برای اطمینان از وجود یک پلاسمید ویژه در باکتری ، اغلب از مقاومت در برابر انتی بیوتیک به عنوان یک علامت انتخاب گر استفاده می شود.تمام پلاسمید ها دست کم دارای یک توالی DNA هستند که می تواند به عنوان یک منشاء همانندسازی (ori)عمل کند، بنابر این ان ها می توانند کاملا مستقل از کروموزوم اصلی باکتری، درون سلول تکثیر پیدا کنند.پلاسمید های کوچک، جهت همانند سازی خود از انزیم های سلول میزبان استفاده می کنند، در حالی که بعضی از پلاسمید های بزرگ تر حامل ژن هایی هستند که انزیم های مخصوص همانندسازی پلاسمید را خود کد می کنند.تعداد نسخه، به تعداد مولکول های یک پلاسمید منفرد که بطور طبیعی در یک سلول باکتری یافت می شوند اطلاق می گردد. بطور کلی تعداد نسخه های یک حامل کلون سازی مطلوب در سلول باید زیاد باشد تا مقدار زیادی مولکول DNA نوترکیب حاصل شود.
پلاسمیدها را براساس نوع ژنشان گروه‌بندی کرده‌اند:
الف-پلاسمیدهای بارور^[۱۱۵] که به آنهاF پلاسمید می‌گویند این پلاسمیدها حاوی ژنی اند به نام ژن tra هستند که سبب انتقال اطلاعات ژنتیکی از طریق همیوغی^[۱۱۶] به باکتری دیگر می‌شوند.
ب-پلاسمیدهای مقاومت یا R^[117]پلاسمیدها که حاوی ژن‌های مقاومت به یک یا چند آنتی بیوتیک اند .
پ-پلاسمیدهای کشنده یا کولیسن سبب تولید پروتئین‌هایی می‌شود که برای باکتری‌های دیگر کشنده ‌اند.
ت-پلاسمیدهای بیماریزا مانند پلاسمیدTiدر ارگوباکتریوم تومفسیانس که باعث گال در گیاهان دولپه‌ای می‌شود.
ث-پلاسمیدهای تجزیه کننده^[۱۱۸] که امکان تجزیه‌ی مولکول‌های غیر طبیعی نظیر تولوئن را به باکتری می‌دهند.
اندازه و تعداد نسخه پلاسمید ها زمانی که کلون سازی مد نظر است بسیار مهم می باشند. قبلا گفته شد که طول DNA کمتر از kb10 برای یک حامل کلون سازی مناسب است. اندازه پلاسمید ها بین kb1 تا بیش از kb250 متغیر است، بنابر این فقط تعداد کمی از ان ها برای کلون سازی مفید می باشند.
با توجه به مطالب ذکر شده، ما در این مطالعه از پلاسمید pet-28a استفاده کردیم که یک پلاسمید بیانی با شاخص ژن مقاومت به انتی بیوتیک کانامایسین می باشد. همانطور که ذکر شده پلاسمید های با اندازه کوچکتر از kb10 برای انتقال ژن مناسب تر هستند. پلاسمید pet28-a دارای bp5369 می باشد، پس از این جهت برای فرایند ترانسفورماسیون مناسب می باشد. به کمک خاصیت مقاومت به انتی بیوتیک ان می توان باکتری های نوترکیب را از باکتری هایی که پلاسمید را دریافت نکرده اند جدا نمود. از طرف دیگر این پلاسمید دارای عواملی است که جهت بیان ژن مورد نظر به ان نیاز دارد. منظور از این عوامل، توالی های نوکلئوتیدی کوچکی است که برای باکتری قابل شناسایی می باشد. این عوامل وجود ژن را به باکتری اطلاع می دهند و زمینه را برای ترجمه ژن مهیا می سازند. سه عامل مهم برای E.coli شامل پروموتر^[۱۱۹] ، پایان دهنده^[۱۲۰] و جایگاه اتصال ریبوزوم^[۱۲۱] می باشد.
الف- پروموتر : نقطه ای که رونویسی از انجا شروع می شود را مشخص می کند. در E.coli پروموتر توسط زیر واحد سیگمای انزیم RNA پلی مراز شناسایی می شود.
ب- پایان دهنده : نقطه ای که امر رونویسی باید در ان پایان یابد را مشخص می کند. پایان دهنده یک توالی نوکلئوتیدی است که می تواند ایجاد یک (stemloop) داده و از ادامه رونویسی جلوگیری کند.
پ- جایگاه اتصال ریبوزوم : یک توالی نوکلئوتیدی کوتاه است که mRNA می تواند توسط ان به ریبوزوم اتصال یابد. کدون شروع کننده ژن در فاصله چند نوکلئوتیدی در پایین دست ان محل قرار دارد.
با وجود شباهت، غیرممکن است که RNA پلی مراز مربوط به E.coli قادر به اتصال به پروموتر یک ژن انسانی باشد و از انجا که E.coli قادر به تشخیص علامت های بیان کننده ژن های بیگانه نیست، یک ژن بیگانه در باکتری E.coli غیر فعال می ماند. برای حل این مشکل، این ژن باید تحت کنترل علامت های مربوط به E.coli قرار بگیرد تا باکتری قادر به تشخیص ان ها باشد. در این صورت ژن مربوطه قادر به نسخه برداری و ترجمه خواهد بود. وسیله هایی که این علامت ها را برای یک ژن خارجی فراهم می سازد به عنوان حامل های بیان شونده^[۱۲۲] نامیده می شوند و با بهره گرفتن از این حامل ها است که یک ژن خارجی می تواند در سلول های E.coli یک پروتئین نوترکیب را تولید کند. پلاسمید pet-28a از جمله این حامل های بیان شونده می باشد.
پروموتر مهم ترین جزء در ساختمان یک حامل بیان شونده می باشد، به این دلیل که پروموتر اولین مرحله بیان ژن را کنترل می کند و ان اتصال انزیم RNA پلی مراز به mRNA می باشد. در نتیجه مقدار پروتئین نوترکیب به میزان زیادی بستگی به ماهیت پروموتر موجود در حامل بیان شونده دارد. پروموتر باید به دقت انتخاب شود. توالی ۱۰- (TATAAT) و ۳۵-(TTGACA) در E.coli ، (ConsensusSequence ) نامیده می شوند. با اینکه در اکثر باکتری ها پروموتر تفاوت زیادی با این توالی ندارند اما همین تفاوت اندک اثر زیادی بر کارایی عمل نسخه برداری دارد. پروموتر های قوی، پروموتر هایی هستند که باعث افزایش نسخه برداری می شوند و این پروموتر ها معمولا ژن هایی را کنترل می کنند که محصول عملی ان ها به میزان زیادی برای سلول لازم است، بر خلاف این پروموتر هایی که ضعیف هستند کارایی چندانی ندارند و عمل نسخه برداری ژن هایی را کنترل می کنند که محصول عمل ان ها به میزان کم مورد نیاز است. واضح است که حامل های بیان شونده باید حاوی پروموتر هایی قوی باشند تا ژن کلون شده بتواند به حداکثرمیزان ممکن نسخه برداری شود و نکته ی دومی که هنگام انتخاب یک حامل بیان شونده باید در نظر داشت این موضوع است که ایا به طریقی امکان کنترل این حامل وجود دارد یا خیر.
دو روش برای کنترل ژن در E.coliوجود دارد.
الف- القاء
ب- سرکوب
یک ژن القاپذیر ژنی است که نسخه برداری از ان با اضافه کردن یک ماده شیمیایی به محیط کشت شروع می شود. معمولا یک ماده شیمیایی سوبسترای انزیمی است که توسط ان ژن کد می شود. برعکس یک ژن سرکوب شدنی، ژنی است که با اضافه کردن یک ماده شیمیایی کنترل کننده خاموش می شود. کنترل ژن در تولید پروتئین های نوترکیب دارای اهمیت زیادی است، برای مثال اگر پروتئین های تولید شده برای باکتری تولید کننده مضر باشد، ساخت پروتئین باید به دقت تحت کنترل قرار بگیرد تا از انباشته شدن میزانی که برای سلول سمی محسوب می شود جلوگیری گردد و این امر با بهره گرفتن از مواد شیمیایی جهت کنترل میزان بیان ژن، ممکن خواهد بود. حتی اگر میزان پروتئین برای سلول باکتری اثر زیان اوری نداشته باشد باز هم کنترل کردن ژن لازم است زیرا نسخه برداری مداوم از یک ژن ممکن است بر قدرت تکثیر پلاسمید اثر بگذارد و باعث شود تا پلاسمید از سلول حذف شود. پروموتر های زیادی در E.coliوجود دارند که هم از قدرت مورد نیاز برخوردار هستند و هم قابل کنترل می باشند.