Vitamins
Glycine
Nicotinic acid
Pyridoxine-HCl
Thiamine-HCl
۵
افزودن مستقیم
۱۰۰
Myo-inositol
۳-۵- کشت اولیه و تولید گیاهچه:
پس از کشت غدههای استریل ارقام ساوالان، سانته، آگریا و مارکیز و تهیه محیط کشت MS، به منظور تعیین بهترین پروتکل ضدعفونی سطحی مواد گیاهی اقدامات زیر صورت گرفت:
- در این مرحله از محیط کشت MS حاوی ۵/. میلیگرم بر لیتر BAP استفاده گردید. استفاده از هورمون BAP به منظور ایجاد تحریک اولیه جهت جوانهزنی و افزایش در سرعت شاخهزایی انجام گرفت.
-
- قطع ساقههای سیبزمینی و انتقال آن به آزمایشگاه: ساقههای غدههای سیبزمینی رشد کرده با قیچی قطع گردیده و به آزمایشگاه منتقل شده و پس از جداسازی برگها به قطعات ۱۰ سانتیمتری حاوی چند گره تقسیم شدند. نکته مهم این که هنگام جداسازی برگها برای جلوگیری از انتقال آلودگیهای احتمالی مقداری از دمبرگ باقی گذاشته شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
- ضدعفونی مواد گیاهی: به منظور تعیین بهترین پروتکل ضدعفونی در این مرحله از سه ترکیب تیماری مختلف استفاده گردید.
- ساقههای استریل شده را به قطعات یک سانتیمتری حاوی یک گره تقسیم و کشت گردیدند. یاد آور میگردد مراحل ۳ و ۴ در شرایط کاملا استریل و زیر هود لامینار انجام گرفته است.
- انتقال به اتاق رشد به مدت یک ماه: تمام کشت ها در اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و دوره نوری ۸ / ۱۶ (شب/روز) و شدت نور ۴۵۰۰ لوکس، تامین شده با لامپهای مهتابی نور سفید، قرار گرفتند.
۳-۶- زیرکشت و تکثیر گیاهچه:
پس از انتقال ریزنمونهها به محیط کشت و اطمینان از عدم آلودگی آنها، نوبت به تکثیر گیاهچهها به مقدار مورد نیاز بود، به همین جهت گیاهچههای درون شیشه ای در شرایط کاملا استریل و در لامینار ایر فلو از لولههای آزمایش خارج شده و به قطعات ۵-۳ سانتیمتری حاوی چند گره قطعه قطعه میشدند.
محیط کشت مورد استفاده در این مرحله محیط کشت مایع انتخاب شد چرا که محیط کشت مایع باعث سرعت رشد بالاتر و افزایش قطر ساقهها گردید که شرایط گیاهچه را برای ورود به مرحله ریزغدهزایی و تحمل شرایط تاریکی کامل و وزن ریزغدهها بهبود بخشید.
محیط کشت استفاده شده در این مرحله محیط MS پایه بدون استفاده از هورمون بود. این امر به دلیل یکسان ساختن شرایط گیاهچهها برای ورود به مراحل انجام آزمایشها و همچنین جلوگیری از وجود تاثیر هورمونها در مرحله بعد و کاهش خطای آزمایش انجام گرفت.
انتقال به اتاق رشد به مدت یک ماه: تمام کشت ها در اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ و دوره نوری ۸ / ۱۶ (شب/روز) و شدت نور ۴۵۰۰ لوکس، تامین شده با لامپهای مهتابی نور سفید، قرار گرفتند. این عمل تا حصول تعداد گیاهچه مورد نیاز برای ورود به مراحل انجام آزمایش جهت بهینهسازی محیط کشت گیاهچه و همچنین محیط کشت بهینه برای ریزغدهزایی ادامه یافت.
۳-۷- آزمایشهای انجام شده:
آزمایشهای انجام شده به دو گروه آزمایشهای مرحله گیاهچه و مرحله ریزغدهزایی تقسیم میگردند. آزمایشهای مرحله گیاهچه که برای بهینهسازی غلظت هورمونها در محیط کشت برای حصول به رشد حداکتری جوانههای تکگره و ایجاد گیاهچه کامل انجام گرفتند که خود به دو دسته آزمایشهای تاثیر هورمونها به صورت تک تک (یک آزمایش در یک زمان) جهت انتخاب هورمونها و غلظتهای مناسب برای تولید گیاهچه و در مرحله بعد بررسی تاثیر متقابل آنها جهت دستیابی به رشد حداکثری تقسیم گردیدند.
دوم آزمایشهای مرحله ریزغدهزایی بودند که آنها نیز به دو دسته تقسیم گردیدند. ابتدا آزمایشهایی که تاثیر هورمونها را به صورت تک تک بر روی گیاهچههای سیبزمینی بررسی مینمود و سپس آزمایشهای تاثیر متقابل هورمونها بر روی یکدیگر انجام گرفتند.
۳-۷-۱- آزمایش ۱: تعیین پروتکل ضدعفونی سطحی مواد گیاهی:
ضدعفونی قبل از کشت ریزنمونه گرهای یکی از نکات مهم میباشد که از چهار تیمار مختلف جهت تعیین بهترین پروتکل ضدعفونی که کمترین آلودگی و بیشترین زنده ماندن گیاهچهها را داشته باشد، استفاده گردید. برای این کار ابتدا با بهره گرفتن از آب لولهکشی به مدت ۳۰ دقیقه ریزنمونهها آبشویی شدند، سپس از الکل ۷۰% به مدت ۶۰ ثانیه، و چهار تیمار هیپوکلریت سدیم ۵/۲ درصد همراه با دو قطره توین ۸۰ به مدت ۷.۵، ۱۰، ۱۲ و ۱۵ دقیقه استفاده گردید و سپس سه مرتبه شستشو با آب مقطر استریل انجام شد. صفاتی که در این آزمایش مورد بررسی قرار گرفت، میزان زندهمانی و میزان آلودگی ریزنمونههای گرهای پس از کشت آنها بود.
۳-۷-۲- آزمایش ۲: بررسی اثر ۲iP بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف ۲iP (5/0، ۰/۱، ۵/۱، ۰/۲ و ۵/۲ میلیگرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظتهای مختلف ۲iP و فاکتور دوم ارقام سیبزمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلیلیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت ، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ و سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه). این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۳- آزمایش ۳: بررسی اثر BAP بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف BAP (5/0، ۰/۱، ۵/۱، ۰/۲ و ۵/۲ میلیگرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظتهای مختلف BAP و فاکتور دوم ارقام سیبزمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلیلیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ و سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه). این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۴- آزمایش ۴: بررسی اثر CCC بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف CCC (25، ۵۰، ۷۵، ۱۰۰ و ۱۲۵ میلیگرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظتهای مختلف CCC و فاکتور دوم ارقام سیبزمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلیلیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ و سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه). این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۵- آزمایش ۵: بررسی اثر GA3 بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف GA3 (۳/۰، ۶/۰، ۹/۰، ۲/۱ و ۵/۱ میلیگرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظتهای مختلف GA3 و فاکتور دوم ارقام سیبزمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلیلیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت ، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ، سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه)، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۲-۵- آزمایش ۶: بررسی اثر Picholoram بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از شش غلظت مختلف Picholoram (0/1، ۰/۲، ۰/۳، ۰/۴، ۰/۵ و ۰/۶ میلیگرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظتهای مختلف Picholoram و فاکتور دوم ارقام سیبزمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلیلیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۲-۶- آزمایش ۷: بررسی اثر NAA بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف NAA (03/0، ۰۶/۰، ۰۹/۰، ۱۲/۰ و ۱۵/۰ میلیگرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظتهای مختلف NAA و فاکتور دوم ارقام سیبزمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلیلیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۲-۷- آزمایش ۸: بررسی اثر متقابل هورمونهای برتر بر روی رشد و نمو گیاهچه:
این آزمایش به منظور بررسی تاثیر متقابل هورمونهایی که در آزمایشهای قبلی استفاده از آنها نسبت به محیط کشت شاهد (فاقد هورمون) اثرهای مثبت نشان داده بودند، انجام گرفت. همچنین غلظتهای مختلف این هورمونها با هم مقایسه و در نهایت هورمونهای برتر با غلظتهای مطلوبتر انتخاب گردیدند. در این آزمایش هورمون BAP با غلظتهای (۰/۰، ۵/۰ و ۱)، هورمون GA3 با سه غلظت (۰/۰، ۶/۰ و ۲/۱) و هورمون NAA با غلظتهای (۰/۰، ۰۳/۰ و ۰۶/۰) حضور داشتند که به صورت تاثیرات تکی، دوگانه و سه گانه مورد آزمایش قرار گرفتند. علت انتخاب غلظت صفر برای تمامی هورمونها به جهت امکان بررسی تاثیرات متقابل دوگانه و تاثیرات تک هورمون بود. این مرحله از آزمایش توسط روش رویه پاسخ[۱۴۶] طرح Box-Behnken طراحی گردید و انجام گرفت.
بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، طول میانگره، تعداد برگ، سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه)، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۳- آزمایشهای مرحله تولید ریزغده:
این سری از آزمایشها به منظور بهینهسازی نوع هورمون و غلظتهای مناسب آنها در محیط کشت برای حصول بیشترین میزان ریزغدهزایی که از نظر وزن ریزغده و سلامت غده نیز دارای کیفیت مناسب باشند انجام گرفت در این مرحله نیز در ابتدا برای یافتن هورمونهایی که دارای تاثیر مطلوب بر ریزغدهزایی هستند ابتدا تاثیر تک تک هورمونها مورد بررسی قرار گرفت و سپس هورمونهای مطلوب همراه با غلظتهای برتر برای آزمایشهای تاثیر متقابل استفاده گردیدند که نتیجه حاصل منجر به انتخاب محیط کشت بهینه از نظر نوع و غلظت هورمون مورد استفاده گردید.
۳-۷-۳-۱- آزمایش ۹: بررسی اثر ۲iP بر روی تولید ریزغده:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف ۲iP (0/1، ۰/۲، ۰/۳، ۰/۴ و ۰/۵ میلیگرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظتهای مختلف ۲iP و فاکتور دوم ارقام سیبزمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار دارای یک ظرف کشت محتوی ۴۰ میلیلیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی گراد و در شرایط تاریکی دایم منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از تعداد ریزغده در هر گیاهچه، اندازه ریزغده، وزن تر ریزغده، وزن خشک ریزغده و تعداد چشم در هر ریزغده. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
[یکشنبه 1401-04-05] [ 11:15:00 ب.ظ ]
|