Vitamins
Glycine
Nicotinic acid
Pyridoxine-HCl
Thiamine-HCl

۵

افزودن مستقیم

۱۰۰

Myo-inositol

۳-۵- کشت اولیه و تولید گیاهچه:
پس از کشت غده­های استریل ارقام ساوالان، سانته، آگریا و مارکیز و تهیه محیط کشت MS، به منظور تعیین بهترین پروتکل ضدعفونی سطحی مواد گیاهی اقدامات زیر صورت گرفت:

• در این مرحله از محیط کشت MS حاوی ۵/. میلی­گرم بر لیتر BAP استفاده گردید. استفاده از هورمون BAP به منظور ایجاد تحریک اولیه جهت جوانه­زنی و افزایش در سرعت شاخه­زایی انجام گرفت.

• • قطع ساقه­های سیب­زمینی و انتقال آن به آزمایشگاه: ساقه­های غده­های سیب­زمینی رشد کرده با قیچی قطع گردیده و به آزمایشگاه منتقل شده و پس از جداسازی برگ­ها به قطعات ۱۰ سانتی­متری حاوی چند گره تقسیم شدند. نکته مهم این که هنگام جداسازی برگ­ها برای جلوگیری از انتقال آلودگی­های احتمالی مقداری از دمبرگ باقی گذاشته شد.

  (( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

• ضدعفونی مواد گیاهی: به منظور تعیین بهترین پروتکل ضدعفونی در این مرحله از سه ترکیب تیماری مختلف استفاده گردید.

• ساقه­های استریل شده را به قطعات یک سانتی­متری حاوی یک گره تقسیم و کشت گردیدند. یاد آور می­گردد مراحل ۳ و ۴ در شرایط کاملا استریل و زیر هود لامینار انجام گرفته است.

• انتقال به اتاق رشد به مدت یک ماه: تمام کشت ها در اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه­ سانتی ­گراد و دوره­ نوری ۸ / ۱۶ (شب/روز) و شدت نور ۴۵۰۰ لوکس، تامین شده با لامپ­های مهتابی نور سفید، قرار گرفتند.

۳-۶- زیر­کشت و تکثیر گیاهچه:
پس از انتقال ریز­نمونه­ها به محیط کشت و اطمینان از عدم آلودگی آن­ها، نوبت به تکثیر گیاهچه­ها به مقدار مورد نیاز بود، به همین جهت گیاهچه­های درون شیشه ­ای در شرایط کاملا استریل و در لامینار ایر فلو از لوله­های آزمایش خارج شده و به قطعات ۵-۳ سانتی­متری حاوی چند گره قطعه قطعه می­شدند.
محیط کشت مورد استفاده در این مرحله محیط کشت مایع انتخاب شد چرا که محیط کشت مایع باعث سرعت رشد بالاتر و افزایش قطر ساقه­ها گردید که شرایط گیاهچه را برای ورود به مرحله ریزغده­زایی و تحمل شرایط تاریکی کامل و وزن ریز­غده­ها بهبود بخشید.
محیط کشت استفاده شده در این مرحله محیط MS پایه بدون استفاده از هورمون بود. این امر به دلیل یکسان ساختن شرایط گیاهچه­ها برای ورود به مراحل انجام آزمایش­ها و هم­چنین جلوگیری از وجود تاثیر هورمون­ها در مرحله بعد و کاهش خطای آزمایش انجام گرفت.
انتقال به اتاق رشد به مدت یک ماه: تمام کشت ها در اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ و دوره­ نوری ۸ / ۱۶ (شب/روز) و شدت نور ۴۵۰۰ لوکس، تامین شده با لامپ­های مهتابی نور سفید، قرار گرفتند. این عمل تا حصول تعداد گیاهچه مورد نیاز برای ورود به مراحل انجام آزمایش جهت بهینه­سازی محیط کشت گیاهچه و هم­چنین محیط کشت بهینه برای ریز­غده­زایی ادامه یافت.
۳-۷- آزمایش­های انجام شده:
آزمایش­های انجام شده به دو گروه آزمایش­های مرحله گیاهچه و مرحله ریزغده­زایی تقسیم می­گردند. آزمایش­های مرحله گیاهچه که برای بهینه­سازی غلظت هورمون­ها در محیط کشت برای حصول به رشد حداکتری جوانه­های تک­گره و ایجاد گیاهچه کامل انجام گرفتند که خود به دو دسته آزمایش­های تاثیر هورمون­ها به صورت تک تک (یک آزمایش در یک زمان) جهت انتخاب هورمون­ها و غلظت­های مناسب برای تولید گیاهچه و در مرحله بعد بررسی تاثیر متقابل آن­ها جهت دست­یابی به رشد حداکثری تقسیم گردیدند.
دوم آزمایش­های مرحله ریز­غده­زایی بودند که آن­ها نیز به دو دسته تقسیم گردیدند. ابتدا آزمایش­هایی که تاثیر هورمون­ها را به صورت تک تک بر روی گیاهچه­های سیب­زمینی بررسی می­نمود و سپس آزمایش­های تاثیر متقابل هورمون­ها بر روی یکدیگر انجام گرفتند.
۳-۷-۱- آزمایش ۱: تعیین پروتکل ضدعفونی سطحی مواد گیاهی:
ضدعفونی قبل از کشت ریزنمونه گره­ای یکی از نکات مهم می­باشد که از چهار تیمار مختلف جهت تعیین بهترین پروتکل ضدعفونی که کمترین آلودگی و بیشترین زنده ماندن گیاهچه­ها را داشته باشد، استفاده گردید. برای این کار ابتدا با بهره گرفتن از آب لوله­کشی به مدت ۳۰ دقیقه ریزنمونه­ها آبشویی شدند، سپس از الکل ۷۰% به مدت ۶۰ ثانیه، و چهار تیمار هیپوکلریت سدیم ۵/۲ درصد همراه با دو قطره توین ۸۰ به مدت ۷.۵، ۱۰، ۱۲ و ۱۵ دقیقه استفاده گردید و سپس سه مرتبه شستشو با آب مقطر استریل انجام شد. صفاتی که در این آزمایش مورد بررسی قرار گرفت، میزان زنده­مانی و میزان آلودگی ریزنمونه­های گره­ای پس از کشت آن­ها بود.
۳-۷-۲- آزمایش ۲: بررسی اثر ۲iP بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف ۲iP (5/0، ۰/۱، ۵/۱، ۰/۲ و ۵/۲ میلی­گرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظت­های مختلف ۲iP و فاکتور دوم ارقام سیب­زمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلی­لیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت ، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ و سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه). این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه ­گیری شدند.
۳-۷-۳- آزمایش ۳: بررسی اثر BAP بر روی رشد و نمو گیاهچه­:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف BAP (5/0، ۰/۱، ۵/۱، ۰/۲ و ۵/۲ میلی­گرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظت­های مختلف BAP و فاکتور دوم ارقام سیب­زمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلی­لیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ و سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه). این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۴- آزمایش ۴: بررسی اثر CCC بر روی رشد و نمو گیاهچه­:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف CCC (25، ۵۰، ۷۵، ۱۰۰ و ۱۲۵ میلی­گرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظت­های مختلف CCC و فاکتور دوم ارقام سیب­زمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلی­لیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ و سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه). این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۵- آزمایش ۵: بررسی اثر GA₃ بر روی رشد و نمو گیاهچه­:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف GA₃ (۳/۰، ۶/۰، ۹/۰، ۲/۱ و ۵/۱ میلی­گرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظت­های مختلف GA₃ و فاکتور دوم ارقام سیب­زمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلی­لیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت ، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ، سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه)، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۲-۵- آزمایش ۶: بررسی اثر Picholoram بر روی رشد و نمو گیاهچه:
در این آزمایش از شش غلظت مختلف Picholoram (0/1، ۰/۲، ۰/۳، ۰/۴، ۰/۵ و ۰/۶ میلی­گرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظت­های مختلف Picholoram و فاکتور دوم ارقام سیب­زمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلی­لیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۲-۶- آزمایش ۷: بررسی اثر NAA بر روی رشد و نمو گیاهچه­:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف NAA (03/0، ۰۶/۰، ۰۹/۰، ۱۲/۰ و ۱۵/۰ میلی­گرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظت­های مختلف NAA و فاکتور دوم ارقام سیب­زمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار حاوی یک ظرف کشت محتوی ۳۰ میلی­لیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، تعداد برگ، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۲-۷- آزمایش ۸: بررسی اثر متقابل هورمون­های برتر بر روی رشد و نمو گیاهچه­:
این آزمایش به منظور بررسی تاثیر متقابل هورمون­هایی که در آزمایش­های قبلی استفاده از آن­ها نسبت به محیط کشت شاهد (فاقد هورمون) اثرهای مثبت نشان داده بودند، انجام گرفت. هم­چنین غلظت­های مختلف این هورمون­ها با هم مقایسه و در نهایت هورمون­های برتر با غلظت­های مطلوب­تر انتخاب گردیدند. در این آزمایش هورمون BAP با غلظت­های (۰/۰، ۵/۰ و ۱)، هورمون GA₃ با سه غلظت (۰/۰، ۶/۰ و ۲/۱) و هورمون NAA با غلظت­های (۰/۰، ۰۳/۰ و ۰۶/۰) حضور داشتند که به صورت تاثیرات تکی، دوگانه و سه گانه مورد آزمایش قرار گرفتند. علت انتخاب غلظت صفر برای تمامی هورمون­ها به جهت امکان بررسی تاثیرات متقابل دوگانه و تاثیرات تک هورمون بود. این مرحله از آزمایش توسط روش رویه پاسخ^[۱۴۶] طرح Box-Behnken طراحی گردید و انجام گرفت.
بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط ۸ ساعت تاریکی و ۱۶ ساعت روشنایی (۴۵۰۰ لوکس) منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از ارتفاع گیاهچه، تعداد شاخساره، تعداد گره، طول میان­گره، تعداد برگ، سطح برگ (اندازه برگ در هر گیاهچه)، تعداد ریشه و طول ریشه. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.
۳-۷-۳- آزمایش­های مرحله تولید ریز­غده:
این سری از آزمایش­ها به منظور بهینه­سازی نوع هورمون و غلظت­های مناسب آن­ها در محیط کشت برای حصول بیشترین میزان ریز­غده­زایی که از نظر وزن ریزغده و سلامت غده نیز دارای کیفیت مناسب باشند انجام گرفت در این مرحله نیز در ابتدا برای یافتن هورمون­هایی که دارای تاثیر مطلوب بر ریزغده­زایی هستند ابتدا تاثیر تک تک هورمون­ها مورد بررسی قرار گرفت و سپس هورمون­های مطلوب همراه با غلظت­های برتر برای آزمایش­های تاثیر متقابل استفاده گردیدند که نتیجه حاصل منجر به انتخاب محیط کشت بهینه از نظر نوع و غلظت هورمون مورد استفاده گردید.
۳-۷-۳-۱- آزمایش ۹: بررسی اثر ۲iP بر روی تولید ریز­غده­:
در این آزمایش از پنج غلظت مختلف ۲iP (0/1، ۰/۲، ۰/۳، ۰/۴ و ۰/۵ میلی­گرم در لیتر) به همراه یک غلظت صفر به عنوان شاهد استفاده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول غلظت­های مختلف ۲iP و فاکتور دوم ارقام سیب­زمینی) با ۳ تکرار که هر تکرار دارای یک ظرف کشت محتوی ۴۰ میلی­لیتر محیط کشت بود، صورت گرفت. بعد ظروف کشت به اتاق رشد با دمای ۲±۲۲ درجه سانتی ­گراد و در شرایط تاریکی دایم منتقل شدند. صفاتی که در این مرحله مورد بررسی قرار گرفت، عبارتند از تعداد ریزغده در هر گیاهچه، اندازه ریز­غده، وزن تر ریز­غده، وزن خشک ریز­غده و تعداد چشم در هر ریزغده. این صفات پس از ۵ هفته از تاریخ زیر کشت اندازه گیری شدند.