کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسید چرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافتهاند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و شامل یک تا سه گروه هیدروکسیل میباشند. کوتینازها میتوانند به عنوان یک رابط بین استرها و لیپیدها در نظر گرفت، این آنزیم استرهای محلول را هیدرولیز می کند و تریگلیسریدها را امولوسیون می کند بنابراین کوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربیزدایی به کار رفته است. از این آنزیم به عنوان یک biocatalyst و یک bioprocesses صنعتی در بیوتکنولوژی استفاده شده است. یکی دیگر از کاربردهای جالب کوتیناز تجزیه پلاستیکها است. به عنوان نمونه، تجزیه پلی کاپرولاکتون که یک پلی استر سنتزی میباشد به محصولات محلول در آب با بهره گرفتن از آنزیم کوتیناز انجام گرفته است. دیگر کاربردهای کوتیناز عبارتند از شرکت در واکنش های سنتزی و هیدرولیتیک میباشد که از جمله آنها میتوان به هیدرولیز چربی شیر در صنایع لبنی، استفاده در صنایع oleochemistry و سنتز تریگلیسریدهای ساختاری اشاره نمود. یکی از خصوصیات ویژه آنزیم کوتیناز، فعالیت آن با گسترهای از سوبستراهای مختلف میباشد که باعث شده این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد استفاده قرار گیرد. این آنزیم همچنین باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی شده است. با توجه به طیف وسیع عملکردی آنزیم در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می تواند در رفع آلودگیهای زیست محیطی نقش مهمی ایفا کند و این ویژگی باعث شده است که این آنزیم در صنعت و بیوتکنولوژی مورد توجه قرار گیرد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
یکی از مشکلات زیست محیطی در جوامع امروزی تجزیهی زبالهها در محیط زیست است. کوتیناز به عنوان یک آنزیم سبز می تواند توانایی از بین بردن زبالههای پلیاستری را دارا باشد و میتوان از آن در سنتز پلیاسترهای قابل تجزیه در طبیعت استفاده کرد.
کوتیناز ها و لیپازها متعلق به گروه استراز ها هستند که قادر به تسریع هیدرولیز باندهای استری هستند. نسبت اجزای سازنده آمینواسیدی کوتیناز باکتریایی به طور کاملا مشخص از کوتیناز قارچی و گیاهی متفاوت است. کوتیناز یک کاتالیست موثر در محیطهای آبی یا ارگانیک است. این مجموعه ویژگیها باعث شده است که این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد توجه قرار گیرد. لذا شناسایی سویههای مختلف بومی تولید کننده این آنزیم از اهمیت خاصی برخوردار است.
با توجه به طیف وسیع عملکردی آنزیم در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می تواند در صنعت, علومکشاورزی و پزشکی نقش مهمی ایفا کند و این ویژگیها باعث شده است که این مطالعه ویژگیهای این آنزیم و شناخت گونه های جدید باکتریایی و قارچی این آنزیم از جایگاه ویژهای برخوردار باشد.
فرضیات واهداف تحقیق
باکتریهایی که قادر به ایجاد بیماری در سطح گیاهان میباشند قادر به تجزیه کوتین این گیاهان اند. میزان بالای کوتین در گیاهان و بخصوص میوه ها، مقاومت بیشتری را در برابر آفات میکروبی فراهم می کند و شناخت این امر به شناسایی حساسیت میوه ها در برابر آفات کمک می کند. بدین منظور از پوست میوههای مختلف کوتین استخراج شد و میزان آن در چند میوه مقایسه شد.
هدف از این پژوهش در مرحله اول مطالعه و مقایسه میزان کوتین در میوههای مختلف و در مرحله بعد جداسازی و شناسایی یک گونه باکتریایی تولید کننده آنزیم کوتیناز میباشد که ممکن است آنزیم کوتیناز آن ویژگی های مطلوبتری نسبت به سایر آنزیم های کوتیناز شناخته شده داشته باشد. گونه ها انتخاب شده در محیط کشت های حاوی کوتین کشت داده می شوند و سپس فعالیت آنزیمی سویههای تولیدکننده کوتیناز با بهره گرفتن از پارا نیترو فنیل بوتیرات سنجیده می شود و سپس توالی ناحیه۱۶S rDNA برای تعیین توالی فرستاده میشوند.
فصل دوم
مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین
اصولا برای اینکه یک آفت گیاهی بتواند به داخل گیاه رخنه کند بایستی از سدهای دفاعی مختلفی عبور کند. این سدهای دفاعی از مواد مختلفی از قبیل مومهای کوتیکولی، کوتین، مواد پکتینی، سلولز، همی سلولز، لیگنین و… تشکیل میشوند. گروههای اصلی مواد شیمیایی مترشحه بوسیله آفات، آنزیمها، مواد سمی، مواد کنترل کننده رشد، پلیساکاریدها و آنتی بیوتیک ها هستند. در بعضی بیماریها مانند پوسیدگیهای آبکی، آنزیم ها به مراتب اهمیت بیشتری دارند. احتمالا تمام دستجات آفاتگیاهی به استثنای ویروس ها و ویروئیدها قادر به ترشح آنزیم ها، مواد کنترل کننده رشد، پلی ساکاریدها و احتمالا مواد سمی هستند. آنزیم های آفات گیاهی اجزای ساختمانی سلولهای میزبان را متلاشی کرده، مواد غذایی داخل سلول ها را تجزیه و یا مستقیما بر روی پروتوپلاسم تأثیر گذاشته و در نفوذ پذیری و عمل غشاها ایجاد اختلال میکنند.
کوتین
کوتین تقریبا تمام بوم سازگانها دارای تنوع گسترده ای از باکتری ها، ویروسها، قارچها، نماتودها، کرم ها، حشرات، پستانداران و سایر جانوران علفخوار هستند. گیاهان به خاطر بافت خود قادر نیستند به سادگی از این گیاهخواران و عوامل بیماریزا دوری کنند بلکه باید از راههای دیگری از خویش حفاظت نمایند. یکی از این راه ها ایجاد لایه کوتین در سطح گیاه است. کوتین دربرابر نفوذ باکتری ها و قارچها سدهایی را ایجاد می کند [۵].
همه بخشهای گیاه که در معرض هوا هستند با لایه ای از مواد چرب پوشیده شده اند که موجب کاهش اتلاف آب شده و در ممانعت از ورود قارچها و باکتری های بیماریزا به گیاه کمک می کند. اجزاء اصلی این پوششها کوتین، سوبرین و مومها هستند [۶]. کوتین روی اکثر بخشهای هوایی و سوبرین روی بخشهای زیرزمینی، ساقههای چوبی و زخمهای التیام یافته وجود دارد. مومها با هر دو ماده سوبرین و کوتین همراه هستند [۵].
مومها ماکرومولکول نیستند اما مخلوط پیچیدهای از آسیل لیپیدهای بلند زنجیر هستند که خاصیت آبگریزی شدیدی دارند. عمدهترین اجزاء مومها آلکانها و الکلهای زنجیرهای بدون انشعاب ۲۵ تا ۳۵ کربنی هستند (شکل۲-۱). زنجیرههای بلند آلدئیدی، کتونی، استری و اسیدهای چرب آزاد نیز در آن یافت میشوند. موم پوستک به وسیله یاختههای روپوستی سنتز میگردد. مومها با عبور از منافذ دیواره اسکلتی به وسیله سازوکارهای نامعلومی یاختههای روپوستی را به صورت ریز قطرههایی ترک مینمایند. پوشش فوقانی موم پوستک اغلب به صورت الگوی پیچیدهای از میلهها، لولهها، یا صفحات متبلور دیده میشوند.
کوتین، سوبرین و مومهای همراه آنها سدی را بین گیاه و محیط آن تشکیل می دهند که وظیفه آن حفظ آب در درون و حفاظت گیاه در برابر عوامل بیماریزا در بیرون است. پوستک در کاهش تلفات آب از اندامهای هوایی گیاه بسیار موثر است اما به طور کامل مانع از تعرق نمیگردد زیرا حتی با بسته شدن روزنهها مقداری آب از دست میرود. ضخامت پوستک با شرایط محیطی تغییر می کند. گونه های گیاهی مناطق خشک نسبت به زیستگاههای مرطوب دارای پوستک ضخیمتری هستند، البته گیاهان زیستگاههای مرطوب وقتی در شرایط خشک رشد می کنند غالبا ضخامت پوستک خود را افزایش می دهند.
پوستک و بافتهای سوبرینی شده هر دو در ممانعت از ورود قارچها و باکتری ها مهم هستند.گرچه آنها در مقاومت به عوامل بیماریزا اهمیت زیادی ندارند. بسیاری از قارچها با روشهای مکانیکی و مستقیما از سطح گیاه نفوذ می کنند. قارچهای دیگر کوتیناز تولید نمیکنند، آنزیمی که کوتین را هیدرولیز و بنابراین ورود به گیاه را تسهیل می کند.
پوشش بیرونی از موجودات زنده شامل پلیمری ضد آب است از چربی های غیر قطبی که در مجموع واکس نامیده می شود. کیتین به عنوان جزء ساختاری در حیوانات عمل می کند در حالی که کوتین به عنوان یک جزء ساختاری از پوشش بیرونی (کوتیکول) بیشتر گیاهان عمل می کند. کوتیکول یک مانع در برابر خشکی است.
مطالعات در مورد کوتیکول گیاهان از قرن نوزدهم آغازشده است. اصطلاح کوتین از کوتوس[۴] گرفته شده است، این اصطلاح برای توصیف ماده ای که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده است و در برابر اسیدهای قوی مقاوم بود استفاده شده است.
کوتین جزء ساختاری کوتیکول گیاهان عالی را تشکیل می دهد. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی میکنند مانند چمن دریا[۵]، زئوسترا مارینا[۶] دارای کوتین هستند که از همان نوع مونومرهایی که در گیاهان خشکی یافت می شود تشکیل شده است. شواهدی وجود دارد که نشان می دهد کوتیکول در گیاهان پست از قبیل خزه، lycopods، سرخس و liverworts وجود دارد. پوستک متشکل از یک لایه بیرونی موم، یک لایه ضخیم میانی از کوتین موم اندود (پوستک واقعی) و یک لایه زیرین ساخته شده از کوتین و موم مخلوط با مواد پکتینی، سلولزی و کربوهیدراتهای دیواره اسکلتی است. پژوهشهای اخیر پیشنهاد مینماید که پوستک علاوه بر کوتین دارای نوع دومی از لیپیدی چرب نیز هست که از هیدروکربنهای بلند زنجیر به نام کوتان ساخته شده است [۷].
شکل ۲‑۱ ترسیم نمای ساختمان پوستک گیاه A) مرحله گستردگی کامل برگ B) تصویری با میکروسکوپ الکترونی از پوستک برگ بزرگنمایی ۵۱۰۰۰ برابر [۸]
کوتین یک ماکرومولکول، پلیمری و متشکل از تعدادی زیادی از اسیدهای چرب بلند زنجیر است که به وسیله پیوندهای استری به یکدیگر متصل شده و یک شبکه سه بعدی سخت را به وجود میآورند. کوتین از اسیدهای چرب ۱۶و ۱۸با گروه های هیدروکسیل یا اپوکسید اشباع شده در وسط یا انتهایی مقابل کربوکسیلیک اسید ساخته شده است [۹, ۱۰].
اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و شامل یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند(شکل ۲-۲). کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته اند.
۲‑۲ مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید [۱۱]
بررسی ساختارهای کوتیکولی نشان میدهد که کوتین حاوی لایه ای است که به دیواره سلول های اپیدرمی با یک لایهpectinaceous glue متصل شده است (شکل ۲-۳). با این حال این یک تصویر کلی ساده است و در واقع مرزهای بین دیواره سلولی ،پکتین و لایه ی کوتین همیشه به طور واضح تعریف نشده زیرا که معمولا در نزدیکی مرزها اختلاط وجود دارد. لایه کوتیکولی به وسیله میکروسکوپ بیشتر در اندام های گیاهی متمایز مشخص می شود(شکل ۲-۴). کوتین نه تنها در تمام سطوح بخش های هوایی گیاهان از جمله ساقه، دمبرگ، برگ، قطعات گل، میوه و برخی از پوشش های بذر یافت می شود بلکه در بخش های داخلی مانند کیسه آب مرکبات نیز وجود دارد. ضخامت پلیمر در میان گونه ها واندام ها ی یک گیاه متفاوت است.
شکل ۲‑۳ نمایش شماتیکی از کوتیکول [۱۲]
شکل ۲‑۴ a) ساختمان غیر مشخص و بینظم کوتیکول با میکروسکوپ الکترونی b) برآمدگیهای کوتین میوه گوجه فرنگی با میکروسکوپ الکترونی [۱۲]
در برگ گیاهان عالی، ضخامت کوتین بین ۵/۰ تا ۱۴میکرو متر با ۲۰ تا ۶۰۰ میکروگرم کوتین در هر cm2 از سطح برگ میباشد. در برخی از میوه ها کوتیکول به خوبی توسعه یافته، محتوای کوتین ممکن است به۱٫۵ میلی گرم درهر cm2 برسد. در گیاهان پست تر معمولا کوتیکول بسیار نازک است (۱/۰ میکرو متر).
بررسی میکروسکوپ الکترونی از منطقه کوتیکولی نشان می دهد که لایه حاوی کوتین بیشتر بی شکل است. در این ماتریس، تیغه و fibrillae ممکن است یافت شود و در صورت امکان ساختار سیستم anastomosing را تشکیل می دهند. با توجه به وجود چنین ویژگی ها و فراساختمان کوتیکولی به شش گروه دسته بندی شده است.اهمیت بیولوژیکی مانند ظواهر متمایز مشخص نیست، اما ساختار anastomosing و مشبک ممکن است در حمل و نقل مواد از طریق کوتیکول نقش داشته باشد.
جداسازی کوتین
با شکستن pectinaceous که کوتیکول را به لایه اپیدرمی متصل می کند توسط آنزیم ها و یا مواد شیمیایی ،لایه کوتیکولی را ازاد می کند. شایع ترین روش مورد استفاده درمان با اگزالات آمونیوم / اسید اگزالیک و یا انزیم pectindegrading می باشد. لایه کوتیکولی که آزاد شده است می تواند به صورت فیزیکی از هم جدا شود و در تیمار با انزیم هیدرولیز کننده کربوهیدرات، کربوهیدرات اضافی حذف شود.
دپلیمریزاسیون کوتین
کوتین را می توان با دپلیمریزاسیون باندهای استری تجزیه نمود و بسته به روش تجزیه آنها مونومرهای کوتین یا مشتقات آنها آزاد می شود. این پلی استر را همچنین می توان با آنزیمهایی که هیدرولیزباندهای استری را کاتالیز می کند دپلیمریزه و تجزیه نمود.
دپلیمریزاسیون شیمیایی
از آنجا که کوتین عمدتا پلی استر است، با برش باندهای استری می توان مونومرها را آزاد نمود. روشهای معمول مورد استفاده عبارتند ازهیدرولیز قلیایی، تبادل استری با متانول حاوی boron trifluoride یا سدیم متوکسید، برش کاهشی با LiAlH4 یا LiAlD4 در تتراهیدروفوران و یا با تری متیل لیزیل یدید در حلال های آلی. عملکرد این روش یا مشتقات آنها در این روش براساس روش دپلیمرازیسیون است.
کوتین می تواند شامل گروه های functional از قبیل اپوکسیدها و آلدئیدها باشد که به روش دپلیمرازیسیون پایدار نیستند در طول دپلیمریزاسیون چنین گروه های عملکردی ممکن است به مشتقاتی تبدیل شوند که برای شناسایی گروه های عملکردی پلیمر ممکن است مفید باشد. به عنوان مثال، در طول depolymerization کاهشی با LiAlD4، اپوکسید و آلدهید ومشتقات D-labeled تولید می شود. پس از آن طیف سنجی جرمی می تواند به راحتی این مارکر را در تولیدات کاهشی ردیابی کند و در نتیجه اپوکسی یا oxo در پلیمر اولیه شناسایی می شود.
دپلیمریزاسیون آنزیمی
از آنجایی که اکثر مونومرها توسط پیوندهای به هم می چسبند، استراز ها می توانند این پلیمر را بشکنند. لیپاز پانکراس می تواند کوتین را تجزیه کرده، در نتیجه الیگومرها و مونومرها آزاد می شوند. مدارک و شواهد ارائه شده نشان داده است که نمک های صفراوی آنزیم را در سطح پلیمر نامحلول تثبیت می کند. همچنین تعامل سطح پلیمر با سیستم lipase±colipase±bile salt مشابه با مشاهدات با تریگلیسرید است. در میکروارگانیسم هایی مانند قارچ و باکتری ترکیب پلی استر هیدرولازی لیپازی و کوتیناز یک پلی استر خاص تکامل یافته است. اولین کوتینازی که تخلیص و شناسایی شد کوتیناز قارچی بود. این آنزیم نشان داد که الیگومرها و مونومرها را آزاد می کند. پس از عملکرد کوتیناز ترجیحا استر الکل اولیه رها می شود و الیگومر انزیمی جدا شده برای مطالعات ساختاری مناسب است که دارای اتصالات متقاطع با باندهای استر الکل های ثانویه است.
مونومرهای تشکیل دهنده کوتین
مونومرهایی که به وسیله ی روش دپلیمریزاسیون شیمیایی تولید میشوند را می توان به وسیله ی کروماتوگرافی (TLC ) در ژل سلیکا جداسازی نمود و دستههای مختلف (بسته به نوع و پلاریته انها) مانند هیدروکسی- دی هیدروکسی – تری هیدروکسی و مشتقات اسید های چرب را از هم تفکیک نمود. انتخاب سیستم های حلال بسته به روش های دپلیمریزاسیون که استفاده می شود متفاوت است. باندهای جدا شده توسط TLC پس از ساخت مشتقات مناسب از آنها وارد سیستم (gas-liquid chromatography/mass spectrometry(GC/MS میگردند.
شکست هیدروژنولیتیک با LiAlD4 تولید مونومر را کاهش می دهد که می تواند قبل ازGC/MS تری متیل سیلیته شود.
اگر از یک روش هیدرولیتیک استفاده شود هر دو گروه کربوکسیل و گروه هیدروکسیل نیاز دارند که مشتق شوند. هرچند که تری متیل سیلاسیون مشتقات گروه های کربوکسیل و هیدروکسیل ، مشتقات trimethylsilyl (TMSi) از متیل استرها گروه های جدا شده را بهتر تشخیص می دهد. با این حال طیف سنجی جرمی برای شناسایی مطمئن از ساختار مونومر لازم است. از این رو GC/MS یک روش انتخابی برای تعیین ساختار و ترکیب مونومرها میباشد. معمولا مخلوط مونومر بدست امده توسط یکی از روش های دپلیمریزاسیون می تواند مشتق شود و به طور مستقیم توسط ترکیبGC/MS مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد.
نتایج بدست امده از تجزیه و تحلیل انجام شده روی کوتین بسیاری از گیاهان نشان داده که این پلی استر گیاهی عمدتا از مونومرهای خانواده های c16 و c18 تشکیل شده است. اجزا اصلی و رایج از خانوادهc16 از مونومرها hydroxyhexadecanoic acid -16 و dihydroxyhexadecanoic acid16 و۱۰ است. این دی هیدروکسی اسید معمولا جز غالب است و معمولا مخلوطی از ایزومرهای موقعیتی با طول متوسط زنجیره وجود دارد. در برخی موارد مشتقات دیگر C-16 می تواند قابل توجه یا عمده ترین جزء باشد. برای مثال-oxo-C16 acid 10-hydroxy-16 در کوتین مرکبات و oxo-9-16 یا acid 10-hydroxy-C16در برگ های بسیار جوان یا شاخه های جنینی باقلا (Vicia faba ) از اجزای اصلی تشکیل دهنده کوتین میباشد. در برخی موارد (به ویژه گیاهان پست) مونومر c16 از قبیل hexadecanetriol 1,8,16- که یکی از اجزاء مهم است.
-
-
- آنزیم
-
[یکشنبه 1401-04-05] [ 08:23:00 ب.ظ ]
|