کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسید چرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و شامل یک تا سه گروه هیدروکسیل می­باشند. کوتینازها می­توانند به عنوان یک رابط بین استرها و لیپیدها در نظر گرفت، این آنزیم استرهای محلول را هیدرولیز می­ کند و تری­گلیسریدها را امولوسیون می­ کند بنابراین کوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربی­زدایی به کار رفته است. از این آنزیم به عنوان یک biocatalyst و یک bioprocesses صنعتی در بیوتکنولوژی استفاده شده است. یکی دیگر از کاربردهای جالب کوتیناز تجزیه پلاستیک­ها است. به عنوان نمونه، تجزیه پلی کاپرولاکتون که یک پلی استر سنتزی می­باشد به محصولات محلول در آب با بهره گرفتن از آنزیم کوتیناز انجام گرفته است. دیگر کاربردهای کوتیناز عبارتند از شرکت در واکنش های سنتزی و هیدرولیتیک می­باشد که از جمله آنها می­توان به هیدرولیز چربی شیر در صنایع لبنی، استفاده در صنایع oleochemistry و سنتز تری­گلیسریدهای ساختاری اشاره نمود. یکی از خصوصیات ویژه آنزیم کوتیناز، فعالیت آن با گستره­ای از سوبستراهای مختلف می­باشد که باعث شده این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد استفاده قرار گیرد. این آنزیم همچنین باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی کشاورزی شده است. با توجه به طیف وسیع عملکردی آنزیم در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می تواند در رفع آلودگی­های زیست محیطی نقش مهمی ایفا کند و این ویژگی باعث شده است که این آنزیم در صنعت و بیوتکنولوژی مورد توجه قرار گیرد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

یکی از مشکلات زیست محیطی در جوامع امروزی تجزیه­ی زباله­ها در محیط زیست است. کوتیناز به عنوان یک آنزیم سبز می ­تواند توانایی از بین بردن زباله­های پلی­استری را دارا باشد و می­توان از آن در سنتز پلی­استرهای قابل تجزیه در طبیعت استفاده کرد.
کوتیناز ها و لیپازها متعلق به گروه استراز ها هستند که قادر به تسریع هیدرولیز باندهای استری هستند. نسبت اجزای سازنده آمینواسیدی کوتیناز باکتریایی به طور کاملا مشخص از کوتیناز قارچی و گیاهی متفاوت است. کوتیناز یک کاتالیست موثر در محیط­های آبی یا ارگانیک است. این مجموعه ویژگی­ها باعث شده است که این آنزیم در صنعت و تکنولوژی مورد توجه قرار گیرد. لذا شناسایی سویه­های مختلف بومی تولید کننده این آنزیم از اهمیت خاصی برخوردار است.
با توجه به طیف وسیع عملکردی آنزیم در برابر سوبستراهای متنوع و قابلیت تجزیه و سنتز انواع ترکیبات پلی استری، این آنزیم می تواند در صنعت, علوم­کشاورزی و پزشکی نقش مهمی ایفا کند و این ویژگی­ها باعث شده است که این مطالعه ویژگی­های این آنزیم و شناخت گونه­ های جدید باکتریایی و قارچی این آنزیم از جایگاه ویژه­ای برخوردار باشد.
فرضیات واهداف تحقیق
باکتری­هایی که قادر به ایجاد بیماری در سطح گیاهان می­باشند قادر به تجزیه کوتین این گیاهان اند. میزان بالای کوتین در گیاهان و بخصوص میوه­ ها، مقاومت بیشتری را در برابر آفات میکروبی فراهم می­ کند و شناخت این امر به شناسایی حساسیت میوه­ ها در برابر آفات کمک می­ کند. بدین منظور از پوست میوه­های مختلف کوتین استخراج شد و میزان آن در چند میوه مقایسه شد.
هدف از این پژوهش در مرحله اول مطالعه و مقایسه میزان کوتین در میوه­های مختلف و در مرحله بعد جداسازی و شناسایی یک گونه باکتریایی تولید کننده آنزیم کوتیناز می­باشد که ممکن است آنزیم کوتیناز آن ویژگی های مطلوب­تری نسبت به سایر آنزیم­ های کوتیناز شناخته شده داشته باشد. گونه ها انتخاب شده­ در محیط کشت های حاوی کوتین کشت داده می شوند و سپس فعالیت آنزیمی سویه­های تولیدکننده کوتیناز با بهره گرفتن از پارا نیترو فنیل بوتیرات سنجیده می­ شود و سپس توالی ناحیه۱۶S rDNA برای تعیین توالی فرستاده می­شوند.
فصل دوم
مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین
اصولا برای‌ اینکه‌ یک‌ آفت گیاهی‌ بتواند به‌ داخل‌ گیاه‌ رخنه‌ کند بایستی‌ از سدهای‌ دفاعی‌ مختلفی‌ عبور کند. این‌ سدهای ‌دفاعی‌ از مواد مختلفی‌ از قبیل‌ موم‌های‌ کوتیکولی‌، کوتین‌، مواد پکتینی‌، سلولز، همی‌ سلولز، لیگنین‌ و… تشکیل‌ می‌شوند. گروه­‌های‌ اصلی‌ مواد شیمیایی‌ مترشحه‌ بوسیله‌ آفات، آنزیم­ها، مواد سمی‌، مواد کنترل‌ کننده رشد، پلی‌­ساکاریدها و آنتی‌ بیوتیک ها هستند. در بعضی‌ بیماری­ها مانند پوسیدگی‌های‌ آبکی‌، آنزیم ها به‌ مراتب‌ اهمیت‌ بیشتری‌ دارند. احتمالا تمام‌ دستجات‌ آفات‌گیاهی‌ به‌ استثنای‌ ویروس ها و ویروئیدها قادر به‌ ترشح‌ آنزیم ها، مواد کنترل‌ کننده‌ رشد، پلی‌ ساکاریدها و احتمالا مواد سمی‌ هستند. آنزیم­ های‌ آفات‌ گیاهی‌ اجزای‌ ساختمانی‌ سلول­های‌ میزبان‌ را متلاشی‌ کرده، مواد غذایی‌ داخل‌ سلول ها را تجزیه‌ و یا مستقیما بر روی‌ پروتوپلاسم‌ تأثیر گذاشته‌ و در نفوذ پذیری‌ و عمل‌ غشاها ایجاد اختلال‌ می‌کنند.
کوتین
کوتین تقریبا تمام بوم سازگان­ها دارای تنوع گسترده ای از باکتری­ ها، ویروس­ها، قارچ­ها، نماتودها، کرم ها، حشرات، پستانداران و سایر جانوران علفخوار هستند. گیاهان به خاطر بافت خود قادر نیستند به سادگی از این گیاهخواران و عوامل بیماری­زا دوری کنند بلکه باید از راه­های دیگری از خویش حفاظت نمایند. یکی از این راه ها ایجاد لایه کوتین در سطح گیاه است. کوتین دربرابر نفوذ باکتری­ ها و قارچ­ها سدهایی را ایجاد می­ کند [۵].
همه بخش­های گیاه که در معرض هوا هستند با لایه ای از مواد چرب پوشیده شده ­اند که موجب کاهش اتلاف آب شده و در ممانعت از ورود قارچ­ها و باکتری­ های بیماری­زا به گیاه کمک می­ کند. اجزاء اصلی این پوشش­ها کوتین، سوبرین و موم­ها هستند [۶]. کوتین روی اکثر بخش­های هوایی و سوبرین روی بخش­های زیرزمینی، ساقه­های چوبی و زخم­های التیام یافته وجود دارد. موم­ها با هر دو ماده سوبرین و کوتین همراه هستند [۵].
موم­ها ماکرومولکول نیستند اما مخلوط پیچیده­ای از آسیل لیپیدهای بلند زنجیر هستند که خاصیت آبگریزی شدیدی دارند. عمده­ترین اجزاء موم­ها آلکان­ها و الکل­های زنجیره­ای بدون انشعاب ۲۵ تا ۳۵ کربنی هستند (شکل۲-۱). زنجیره­های بلند آلدئیدی، کتونی، استری و اسیدهای چرب آزاد نیز در آن یافت می­شوند. موم پوستک به وسیله­ یاخته­های روپوستی سنتز می­گردد. موم­ها با عبور از منافذ دیواره اسکلتی به وسیله سازوکارهای نامعلومی یاخته­های روپوستی را به صورت ریز قطره­هایی ترک می­نمایند. پوشش فوقانی موم پوستک اغلب به صورت الگوی پیچیده­ای از میله­ها، لوله­ها، یا صفحات متبلور دیده می­شوند.
کوتین، سوبرین و موم­های همراه آنها سدی را بین گیاه و محیط آن تشکیل می­ دهند که وظیفه آن حفظ آب در درون و حفاظت گیاه در برابر عوامل بیماری­زا در بیرون است. پوستک در کاهش تلفات آب از اندام­های هوایی گیاه بسیار موثر است اما به طور کامل مانع از تعرق نمی­گردد زیرا حتی با بسته شدن روزنه­ها مقداری آب از دست می­رود. ضخامت پوستک با شرایط محیطی تغییر می­ کند. گونه­ های گیاهی مناطق خشک نسبت به زیستگاه­های مرطوب دارای پوستک ضخیم­تری هستند، البته گیاهان زیستگاه­های مرطوب وقتی در شرایط خشک رشد می­ کنند غالبا ضخامت پوستک خود را افزایش می­ دهند.
پوستک و بافت­های سوبرینی شده هر دو در ممانعت از ورود قارچ­ها و باکتری­ ها مهم هستند.گرچه آنها در مقاومت به عوامل بیماری­زا اهمیت زیادی ندارند. بسیاری از قارچ­ها با روش­های مکانیکی و مستقیما از سطح گیاه نفوذ می­ کنند. قارچ­های دیگر کوتیناز تولید نمی­کنند، آنزیمی که کوتین را هیدرولیز و بنابراین ورود به گیاه را تسهیل می­ کند.
پوشش بیرونی از موجودات زنده شامل پلیمری ضد آب است از چربی های غیر قطبی که در مجموع واکس نامیده می شود. کیتین به عنوان جزء ساختاری در حیوانات عمل می کند در حالی که کوتین به عنوان یک جزء ساختاری از پوشش بیرونی (کوتیکول) بیشتر گیاهان عمل می کند. کوتیکول یک مانع در برابر خشکی است.
مطالعات در مورد کوتیکول گیاهان از قرن نوزدهم آغازشده است. اصطلاح کوتین از کوتوس^[۴] گرفته شده است، این اصطلاح برای توصیف ماده ای که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده است و در برابر اسیدهای قوی مقاوم بود استفاده شده است.
کوتین جزء ساختاری کوتیکول گیاهان عالی را تشکیل می دهد. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی میکنند مانند چمن دریا^[۵]، زئوسترا مارینا^[۶] دارای کوتین هستند که از همان نوع مونومرهایی که در گیاهان خشکی یافت می شود تشکیل شده است. شواهدی وجود دارد که نشان می دهد کوتیکول در گیاهان پست از قبیل خزه، lycopods، سرخس و liverworts وجود دارد. پوستک متشکل از یک لایه بیرونی موم، یک لایه ضخیم میانی از کوتین موم اندود (پوستک واقعی) و یک لایه زیرین ساخته شده از کوتین و موم مخلوط با مواد پکتینی، سلولزی و کربوهیدرات­های دیواره اسکلتی است. پژوهش­های اخیر پیشنهاد می­نماید که پوستک علاوه بر کوتین دارای نوع دومی از لیپیدی چرب نیز هست که از هیدروکربن­های بلند زنجیر به نام کوتان ساخته شده است [۷].
شکل ‏۲‑۱ ترسیم نمای ساختمان پوستک گیاه A) مرحله گستردگی کامل برگ B) تصویری با میکروسکوپ الکترونی از پوستک برگ بزرگنمایی ۵۱۰۰۰ برابر [۸]
کوتین یک ماکرومولکول، پلیمری و متشکل از تعدادی زیادی از اسیدهای چرب بلند زنجیر است که به وسیله پیوندهای استری به یکدیگر متصل شده و یک شبکه سه بعدی سخت را به وجود می­آورند. کوتین از اسیدهای چرب ۱۶و ۱۸با گروه ­های هیدروکسیل یا اپوکسید اشباع شده در وسط یا انتهایی مقابل کربوکسیلیک اسید ساخته شده است [۹, ۱۰].
اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و شامل یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند(شکل ۲-۲). کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته اند.
‏۲‑۲ مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید [۱۱]
بررسی ساختارهای کوتیکولی نشان می­دهد که کوتین حاوی لایه ای است که به دیواره سلول های اپیدرمی با یک لایهpectinaceous glue متصل شده است (شکل ۲-۳). با این حال این یک تصویر کلی ساده است و در واقع مرزهای بین دیواره سلولی ،پکتین و لایه ی کوتین همیشه به طور واضح تعریف نشده زیرا که معمولا در نزدیکی مرزها اختلاط وجود دارد. لایه کوتیکولی به وسیله میکروسکوپ بیشتر در اندام های گیاهی متمایز مشخص می شود(شکل ۲-۴). کوتین نه تنها در تمام سطوح بخش های هوایی گیاهان از جمله ساقه، دمبرگ، برگ، قطعات گل، میوه و برخی از پوشش های بذر یافت می شود بلکه در بخش های داخلی مانند کیسه آب مرکبات نیز وجود دارد. ضخامت پلیمر در میان گونه ها واندام ها ی یک گیاه متفاوت است.
شکل ‏۲‑۳ نمایش شماتیکی از کوتیکول [۱۲]

شکل ‏۲‑۴ a) ساختمان غیر مشخص و بی­نظم کوتیکول با میکروسکوپ الکترونی b) برآمدگی­های کوتین میوه گوجه­ فرنگی با میکروسکوپ الکترونی [۱۲]
در برگ گیاهان عالی، ضخامت کوتین بین ۵/۰ تا ۱۴میکرو متر با ۲۰ تا ۶۰۰ میکروگرم کوتین در هر cm² از سطح برگ می­باشد. در برخی از میوه ها کوتیکول به خوبی توسعه یافته، محتوای کوتین ممکن است به۱٫۵ میلی گرم درهر cm² برسد. در گیاهان پست تر معمولا کوتیکول بسیار نازک است (۱/۰ میکرو متر).
بررسی میکروسکوپ الکترونی از منطقه کوتیکولی نشان می دهد که لایه حاوی کوتین بیشتر بی شکل است. در این ماتریس، تیغه و fibrillae ممکن است یافت شود و در صورت امکان ساختار سیستم anastomosing را تشکیل می دهند. با توجه به وجود چنین ویژگی ها و فراساختمان کوتیکولی به شش گروه دسته بندی شده است.اهمیت بیولوژیکی مانند ظواهر متمایز مشخص نیست، اما ساختار anastomosing و مشبک ممکن است در حمل و نقل مواد از طریق کوتیکول نقش داشته باشد.
جداسازی کوتین
با شکستن pectinaceous که کوتیکول را به لایه اپیدرمی متصل می کند توسط آنزیم ها و یا مواد شیمیایی ،لایه کوتیکولی را ازاد می کند. شایع ترین روش مورد استفاده درمان با اگزالات آمونیوم / اسید اگزالیک و یا انزیم pectindegrading می باشد. لایه کوتیکولی که آزاد شده است می تواند به صورت فیزیکی از هم جدا شود و در تیمار با انزیم هیدرولیز کننده کربوهیدرات، کربوهیدرات اضافی حذف شود.
دپلیمریزاسیون کوتین
کوتین را می توان با دپلیمریزاسیون باندهای استری تجزیه نمود و بسته به روش تجزیه آنها مونومرهای کوتین یا مشتقات آنها آزاد می­ شود. این پلی استر را همچنین می توان با آنزیم­هایی که هیدرولیزباندهای استری را کاتالیز می کند دپلیمریزه و تجزیه نمود.
دپلیمریزاسیون شیمیایی
از آنجا که کوتین عمدتا پلی استر است، با برش باندهای استری می توان مونومرها را آزاد نمود. روش­های معمول مورد استفاده عبارتند ازهیدرولیز قلیایی، تبادل استری با متانول حاوی boron trifluoride یا سدیم متوکسید، برش کاهشی با LiAlH₄ یا Li­­AlD₄ در تتراهیدروفوران و یا با تری متیل لیزیل یدید در حلال های آلی. عملکرد این روش یا مشتقات آنها در این روش براساس روش دپلیمرازیسیون است.
کوتین می تواند شامل گروه های functional از قبیل اپوکسیدها و آلدئیدها باشد که به روش دپلیمرازیسیون پایدار نیستند در طول دپلیمریزاسیون چنین گروه های عملکردی ممکن است به مشتقاتی تبدیل شوند که برای شناسایی گروه های عملکردی پلیمر ممکن است مفید باشد. به عنوان مثال، در طول depolymerization کاهشی با LiAlD4، اپوکسید و آلدهید ومشتقات D-labeled تولید می­ شود. پس از آن طیف سنجی جرمی می تواند به راحتی این مارکر را در تولیدات کاهشی ردیابی کند و در نتیجه اپوکسی یا oxo در پلیمر اولیه شناسایی می­ شود.
دپلیمریزاسیون آنزیمی
از آنجایی که اکثر مونومرها توسط پیوندهای به هم می چسبند، استراز ها می توانند این پلیمر را بشکنند. لیپاز پانکراس می تواند کوتین را تجزیه کرده، در نتیجه الیگومرها و مونومرها آزاد می شوند. مدارک و شواهد ارائه شده نشان داده است که نمک های صفراوی آنزیم را در سطح پلیمر نامحلول تثبیت می­ کند. همچنین تعامل سطح پلیمر با سیستم lipase±colipase±bile salt مشابه با مشاهدات با تریگلیسرید است. در میکروارگانیسم هایی مانند قارچ و باکتری ترکیب پلی استر هیدرولازی لیپازی و کوتیناز یک پلی استر خاص تکامل یافته است. اولین کوتینازی که تخلیص و شناسایی شد کوتیناز قارچی بود. این آنزیم نشان داد که الیگومرها و مونومرها را آزاد می کند. پس از عملکرد کوتیناز ترجیحا استر الکل اولیه رها می شود و الیگومر انزیمی جدا شده برای مطالعات ساختاری مناسب است که دارای اتصالات متقاطع با باندهای استر الکل های ثانویه است.
مونومرهای تشکیل دهنده کوتین
مونومرهایی که به وسیله ی روش دپلیمریزاسیون شیمیایی تولید می­شوند را می توان به وسیله ی کروماتوگرافی (TLC ) در ژل سلیکا جداسازی نمود و دسته­های مختلف (بسته به نوع و پلاریته انها) مانند هیدروکسی- دی هیدروکسی – تری هیدروکسی و مشتقات اسید های چرب را از هم تفکیک نمود. انتخاب سیستم های حلال بسته به روش های دپلیمریزاسیون که استفاده می شود متفاوت است. باندهای جدا شده توسط TLC پس از ساخت مشتقات مناسب از آنها وارد سیستم (gas-liquid chromatography/mass spectrometry(GC/MS می­گردند.
شکست هیدروژنولیتیک با LiAlD₄ تولید مونومر را کاهش می دهد که می تواند قبل ازGC/MS تری متیل سیلیته شود.
اگر از یک روش هیدرولیتیک استفاده شود هر دو گروه کربوکسیل و گروه هیدروکسیل نیاز دارند که مشتق شوند. هرچند که تری متیل سیلاسیون مشتقات گروه های کربوکسیل و هیدروکسیل ، مشتقات trimethylsilyl (TMSi) از متیل استرها گروه ­های جدا شده را بهتر تشخیص می دهد. با این حال طیف سنجی جرمی برای شناسایی مطمئن از ساختار مونومر لازم است. از این رو GC/MS یک روش انتخابی برای تعیین ساختار و ترکیب مونومرها می­باشد. معمولا مخلوط مونومر بدست امده توسط یکی از روش های دپلیمریزاسیون می تواند مشتق شود و به طور مستقیم توسط ترکیبGC/MS مورد تجزیه و تحلیل قرار گیرد.
نتایج بدست امده از تجزیه و تحلیل انجام شده روی کوتین بسیاری از گیاهان نشان داده که این پلی استر گیاهی عمدتا از مونومرهای خانواده های c16 و c18 تشکیل شده است. اجزا اصلی و رایج از خانوادهc16 از مونومرها hydroxyhexadecanoic acid -16 و dihydroxyhexadecanoic acid16 و۱۰ است. این دی هیدروکسی اسید معمولا جز غالب است و معمولا مخلوطی از ایزومرهای موقعیتی با طول متوسط زنجیره وجود دارد. در برخی موارد مشتقات دیگر C-16 می تواند قابل توجه یا عمده ترین جزء باشد. برای مثال-oxo-C16 acid 10-hydroxy-16 در کوتین مرکبات و oxo-9-16 یا acid 10-hydroxy-C16در برگ های بسیار جوان یا شاخه های جنینی باقلا (Vicia faba ) از اجزای اصلی تشکیل دهنده کوتین می­باشد. در برخی موارد (به ویژه گیاهان پست) مونومر c16 از قبیل hexadecanetriol 1,8,16- که یکی از اجزاء مهم است.

• 1. 1. آنزیم