شاخص­ های ثانویه خون­شناسی برای توصیف اندازه سلول­ها و میزان هموگلوبین آن­ها به­کار می­رود [۴].

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

الف- حجم متوسط گویچه قرمز (MCV)این شاخص حجم متوسط هر یاخته قرمز خون را نشان می­دهد. این شاخص بر حسب فمتولیتر محاسبه می­ شود. هر فمتولیتر برابر یک میکرومتر مکعب است.(۳-۶)
در این رابطه، HCT میزان هماتوکریت و RBC تعداد یاخته­های قرمز خون (بر حسب میلیون در میلی­متر مکعب) را نشان می­دهد [۴].
ب- میانگین غلظت هموگلوبین ذره­ای (MCHC)این شاخص غلظت هموگلوبین در توده یاخته­های قرمز را بر حسب درصد نشان می­دهد.(۳-۷)
در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسی­لیتر) و HCT میزان هماتوکریت را نشان می­دهد [۴].
ج– میانگین هموگلوبین ذره­ای (MCH)این شاخص متوسط هموگلوبین در یک یاخته قرمزخون را بر حسب پیکوگرم نشان می­دهد.(۸-۳)
در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسی­لیتر) و RBC(بر حسب میلیون در میلی­متر مکعب) را نشان می­دهد [۴].
۳-۵- تعیین سن
برای تعیین سن از روش‌ آناتومیکی (فلس) استفاده شد. اساس کار در این روش تغییرات دوره‌ای است که در رشد سالانه ماهی روی می‌دهد.در این بررسی سن ماهیان با بهره گرفتن از بررسی دوایر سنی موجود روی فلس های برداشت شده از ناحیه بین خط جانبی و جلو باله پشتی انجام شد. رشد فلس متناسب با رشد ماهی است. همزمان با رشد فلس، حلقه­های رشد سالیانه در حاشیه فلس تشکیل می شود. حلقه های رشد، یک الگوی متحدالمرکز است که مرتبط با شرایط محیطی و رشد در طی یک سال تشکیل می شود. به کمک این حلقه ها می توان سن ماهی را تعیین کرد [۸۸]. برای زایل نمودن مواد لزج موکوسی روی فلس، شستشوی آن با آب گرم و محلول های تمیز کننده مانند مایع ظرفشویی و سپس آب مقطر انجام شد. فلس‌های آماده شده به کمک میکروسکوپ مطالعه گردید.
۳-۶- محاسبه شاخص توسعه گنادی (GSI)پس از تعیین جنسیت، گنادها به طور کامل خارج و برای محاسبه GSI با دقت ۰۱/۰ گرم وزن گردید. این شاخص به صورت زیر محاسبه می گردد [۱۷]:(۳-۹)
در این رابطه برابر با وزن گناد و برابر با وزن بدن ماهی است.
۳-۷- تهیه بافت گناد
در این مطالعه، بخش میانی گناد تعداد ۵ قطعه ماهی ماده و ۵ قطعه ماهی نر از هر ایستگاه به­ طور تصادفی انتخاب و به منظور انجام مطالعات بافت شناسی در فرمالین ۱۰% قرار داده شد. سپس نمونه ها از مراحل آبگیری از طریق الکل­ با درجات مختلف، شفاف سازی با بهره گرفتن از گزیلول، پارافینه کردن، قالب‌گیری، برش و رنگ‌آمیزی به روش استاندارد هماتوکسیلین-ائوزین عبورداده شد. پس از رنگ­آمیزی با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری مرحله توسعه گنادی در جنس نر و ماده مورد شناسایی قرار گرفت [۷۱].
۳-۸- آماده ­سازی نمونه­ها جهت مطالعات مولکولی و اندازه ­گیری بیان ژن ویتلوژنین
بررسی های مولکولی شامل توالی­یابی ژن کدکننده ویتلوژنین و بررسی بیان آن، در طی دوره فرصت مطالعاتی تحت نظر پروفسور گنزالو مارتینز-ردریگز[۷۱] در مرکز علوم دریایی اندلوسیا[۷۲]، کادیز[۷۳]، اسپانیا اجرا گردید. در تمام پروتوکل­ها شامل کیت­های تجاری مورد استفاده، دستورالعمل شرکت سازنده دنبال شد. تمام آغازگرها از شرکت اینتگریتد DNA تکنولوژیز[۷۴] (کشور بلژیک) خریداری شد. توالی­یابی­ها با روش Dideoxy و توسط شرکت بیوتکنولوژی کمپانی (بیواری)[۷۵] انجام گردید.
۳-۸-۱- نمونه­برداری و تیمار
در این مطالعه حدود ۳۰ میلی­گرم از کبد تعداد ۵ قطعه ماهی ماده و ۵ قطعه ماهی نر از هر ایستگاه به منظور انجام مطالعات مولکولی در تیوب­های ۵ میلی­لیتری حاوی محلول محافظت­کننده از RNA[76] (ساخت شرکت فیت بیوتکنولوژی[۷۷]) قرار داده شد و برای استخراج RNA کل در دمای C°۲۰- قرار گرفت.
از آنجایی­که برای اندازه ­گیری میزان بیان هر ژن داشتن آغازگرهای اختصاصی در همان گونه الزامی است و توالی ژن ویتلوژنین و بتااکتین عروس­ماهی زاینده­رود تاکنون در بانک جهانی ژن به ثبت نرسیده است، لازم بود توالی­یابی و همسانه­سازی[۷۸] این دو ژن برای اولین بار در این گونه صورت پذیرد. از سوی دیگر با وجود ثبات نسبی ژن ویتلوژنین در بین ماهیان، به دلیل وجود ایزوفرم­های متعدد این ژن، به منظور جلوگیری از خطا در زمان اندازه ­گیری بیان ژن و ایجاد محصولات جانبی در واکنش­های زنجیره­ای پلیمراز (PCR)[79]، توالی­یابی کامل این دو ژن انجام گردید و سپس آغازگرهای مناسب برای انجام Real-time PCR از روی آن­ طراحی شد.
با توجه به این­که نمونه­برداری در زمان مورد انتظار برای بالا بودن بیان ژن ویتلوژنین صورت نگرفته بود، گروهی از ماهیان پس از صید به مدت ۲۴ ساعت تحت تیمار ۲۰۰۰ نانوگرم ۱۷بتا-استرادیول/ لیتر قرار گرفتند تا بیان این ژن به میزان کافی برای ساخت cDNA اختصاصی افزایش یابد [۲۹]. کبد آن­ها به تفکیک جنسیت در تیوب­های حاوی محلول محافظت­کننده از RNA و تا زمان استخراج RNA در دمای C°۲۰- قرار گرفت.
۳-۸-۲- استخراج و تعیین کمیت و کیفیت RNA
در تمام نمونه­ها، RNA با بهره گرفتن از کیت نوکلئواسپین RNA II[80] ساخت شرکت مچری-ناجل[۸۱] استخراج شد و هضم DNA بر روی ستون و با بهره گرفتن از آنزیم DNase فاقدRNase موجود در کیت انجام گرفت.
کمیت RNA به روش اسپکتروفتومتری در طول موج ۲۵۰ نانومتر توسط دستگاه بیوفتومترپلاس[۸۲] ساخت شرکت اپندورف[۸۳] مورد بررسی قرار گرفت. به علاوه کیفیت تقریبی آن از طریق دو شاخص که از رابطه میزان جذب نوری در ۲۶۰ نانومتر/ ۲۸۰ نانومتر و همچنین ۲۶۰ نانومتر/ ۲۳۰ نانومتر به­دست می ­آید و مستقیما توسط دستگاه محاسبه می­ شود، مورد ارزیابی قرار گرفت. حداکثر جذب نوری توسط RNA در ۲۶۰ نانومتر صورت می­گیرد. درحالی­که پروتئین دارای حداکثر جذب نوری در ۲۸۰ نانومتر است. بنابراین نسبت جذب نوری در ۲۶۰ نانومتر/ ۲۸۰ نانومتر شاخص مناسبی برای ارزیابی آلودگی­های پروتئینی است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه ۲-۸/۱ قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی می­گردد. برای بررسی بیش­تر کیفیت RNA از نسبت جذب نوری ۲۶۰ نانومتر/ ۲۳۰ نانومتر استفاده می­ شود. اما بر خلاف شاخص نسبت میزان جذب نوری در ۲۶۰ نانومتر/۲۸۰ نانومتر که بیش­تر تحت تاثیر آلاینده­های پروتئینی و نوکلئوتیدی تغییر می­ کند، این شاخص تحت تاثیر تعداد بیش­تری از آلاینده­ها قرار دارد و در نتیجه از دقت کم­تری برخوردار است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه ۲-۷/۱ قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی می­ شود [۷۶].
برای بررسی دقیق­تر کیفیت RNA از دستگاه بیوآنالیزور ۲۱۰۰[۸۴] و کیت RNA نانو ۶۰۰۰[۸۵] ساخت شرکت اجیلنت تکنولوژیز، لایف ساینسیز[۸۶] استفاده شد. این دستگاه با بهره گرفتن از شاخصی به نام RIN [۸۷] کیفیت RNA را نمایش می­دهد. این شاخص به منظور استانداردسازی فرایند تفسیر صحت RNA و حذف تفسیرهای شخصی از کیفیت RNA ابداع شده است که روش ازریابی به روش الکتروفورز نیز در آن مدنظر قرار می­گیرد. این روش چون بر مبنای تعیین چشمی نسبت ریبوزومی (که از تقسیم زیرواحدهای ۱۸S به ۲۸S به دست می ­آید) از روی ژل حاصل از الکتروفورز ایجاد می­ شود، معمولاً با خطا همراه است. در صورتی­که نرم­افزار الگوریتمی RIN، علاوه بر این­که این شاخص را به صورت خودکار تعیین می­ کند، یک سیستم نمره­دهی از ۱ تا ۱۰ ارائه می­دهد که در آن ۱۰ دارای بهترین و ۱ دارای بدترین کیفیت RNA است (شکل ۳-۶) [۷۳].
۳-۸-۳- سنتز cDNA
برای سنتز cDNA جهت توالی­یابی، RNA کل استخراج شده یک نمونه ماهی نر تیمار شده با ۱۷آلفا-استرادیول و همچنین یک نمونه ماهی ماده از ایستگاه چشمه­دیمه انتخاب شد. دلیل انتخاب جنس نر، حساسیت بالاتر این جنس به حضور استروژن­های محیطی و در نتیجه افزایش بیان ویتلوژنین در نتیجه تیمار است.
حدود ۵۰۰ نانوگرم از هریک از آن­ها با بهره گرفتن از کیت سنتز cDNA به نام کیواسکریپت[۸۸] ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز[۸۹] به­ صورت معکوس رونویسی شد. به­ طور خلاصه، واکنش با بهره گرفتن از کیو اسکریپت ری­اکشن میکس[۹۰] (۱X از غلظت نهایی) و کیواسکریپت ریورس ترنسکریپتاز[۹۱] (۵/۲X از غلظت نهایی) انجام گرفت. برنامه رونویسی معکوس شامل ۵ دقیقه در C°۲۲، ۳۰ دقیقه در C°۴۲ و ۵ دقیقه در C°۸۵ بود.
۳-۸-۴- همسانه­سازی cDNA نسبی ویتلوژنین در P. esfahani
آغازگرهای اختصاصی ژن ویتلوژنین از مناطق بسیار باثبات cDNA کامل سایر ماهیان استخوانی طراحی شد (جدول ۳-۲). PCR با بهره گرفتن از ۱ واحد بیوتک DNA پلیمراز[۹۲] (ساخت شرکت بیولاین[۹۳])، cDNA، بافر PCR شرکت سازنده (۱X از غلضت نهایی)، ۵/۰ میکرومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس، ۲/۰ میلی مولار dNTPs و ۵/۱ میلی مولار MgCl2 در حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر انجام شد. برنامه PCR شامل ۱۰ دقیقه واسرشته­سازی اولیه در C°۹۵، ۳۵ سیکل تکثیر (واسرشته­سازی به مدت ۳۰ ثانیه در C°۹۵، الحاق به مدت ۳۰ ثانیه در C°۴/۶۰ و بسط به مدت ۳۰ ثانیه در C°۷۲ ) و ۱۰ دقیقه بسط نهایی در C°۷۲ توسط دستگاه مسترسایکلر پرواس[۹۴] (ساخت شرکت اپندورف) بود.
محصول PCR در ژل آگارز ۱% با TBE 1X رنگ­آمیزی شده با جل رد[۹۵] (ساخت شرکت بیوتیوم[۹۶]) اجرا و توسط سیستم کمی­داک ایکس.آر.اس[۹۷] و به کمک نرم­افزار ایمیج لب[۹۸] (ساخت شرکت بیورد[۹۹]) قابل رویت شد. محصول PCR توسط کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ[۱۰۰] ( ساخت شرکت مچری-ناجل) تصفیه و به منظور توالی­یابی با بهره گرفتن از کیت کلونینگ توپو-تی.آ[۱۰۱] (ساخت شرکت اینویتروژن لایف تکنولوژیز[۱۰۲]) به داخل وکتورpCR®۴TOPO® کلون شد. محصول این کیت برای انتقال به سلول­های Escherichia coli و سپس کشت در پلیت­های آگار LB آمپی­سیلین به مدت یک شب در C°۳۷ مورد استفاده قرار گرفت. پس از کشت ۶ کلون باکتریایی در ۳ میلی­لیتر از محیط کشت مایع LB آمپی­سیلین به مدت یک شب در شیکر C°۳۷، با بهره گرفتن از کیت نوکلئواسپین پلاسمید[۱۰۳] (ساخت شرکت مچری-ناجل) پلاسمید استخراج شد. در هر دو کلون، هر دو رشته­ توسط آغازگرهای مستقیم و معکوسM13 توالی­یابی شد.
۳-۸-۵- همسانه­سازی cDNA نسبی بتا-اکتین در P. esfahani
به منظور حصول توالی اولیه بتا-اکتین در عروس­ماهی زاینده­رود، از آغازگرهای مورد استفاده برای همسانه­سازی نسبی ژن بتا-اکتین در Rhamdia quelen (KC195970) استفاده شد (جدول ۳-۲) [۱۳]. کلیه مراحل PCR، تصفیه، همسانه­سازی و توالی­یابی مطابق با روش بند ۳-۸-۴ انجام گردید.
۳-۸-۶- بسط ویتلوژنین به سمت انتهای َ۳
از آنجایی که انتظار می­رفت فاصله قطعه کوتاه میانی cDNA ویتلوژنین در P. esfahani تا انتهای َ۳ آن بسیار طویل باشد، از استراتژی بسط این قطعه به سمت مناطقی از ژنوم که در بین بسیاری از کپورماهیان باثبات بود، استفاده شد. به این منظور، با بهره گرفتن از سه آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ۳ قطعه ویتلوژنین میانی موجود طراحی شد و ۳ آغازگر دژنره[۱۰۴] معکوس از مناطق باثبات سایر کپورماهیان به­ ویژه گونه ­هایی که در بلاست[۱۰۵] قبلی قطعه ویتلوژنین میانی شباهت بیش­تری را نشان داده بودند، چندین PCR انجام شد (جدول ۳-۲). تمام PCRها مطابق با برنامه بند ۳-۸-۴ انجام گرفت. تنها زمان بسط به ۲ دقیقه و ۳۰ ثانیه افزایش یافت. پس از هر سه Nested PCR، قطعات در ژل آگارز ۱% با TBE 1X اجرا شدند. باندهای دارای اندازه پیش ­بینی شده از داخل ژل بریده و با بهره گرفتن از کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ تصفیه شدند. این قطعات با بهره گرفتن از کیت کلونینگ جت PCR[106] (ساخت شرکت فرمنتاس لایف ساینسیز[۱۰۷]) به داخل وکتور pJET1.2/blunt کلون شدند.
۳-۸-۷- تکثیر سریع دوانتهای cDNA (RACE)[108] در ویتلوژنین
به منظور همسانه­سازی انتهای َ۳ در ویتلوژنین، چندین مرحله PCR با ۴ آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ۳ قطعه طویل شده آن از مرحله قبل طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل ۳’RACE کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس[۱۰۹] (ساخت شرکت امبیون، لایف تکنولوژیز[۱۱۰]) انجام شد. با بهره گرفتن از آداپتور ۳’RACE موجود در کیت، رونویسی معکوس RNA کل صورت گرفت. شرایط PCR مشابه بند ۳-۸-۴ بود.
برای کلون انتهای َ۵ از پروتوکل ۵’RACE کیت مذکور استفاده شد. در این پروتوکل به­ طور خلاصه cDNA با بهره گرفتن از ۱ میکروگرم RNA کل به همراه دسامرهای تصادفی موجود در کیت سنتز گردید. دو مرحله PCR با شرایط مشابه بند ۳-۸-۴ و با بهره گرفتن از ۲ آغازگر معکوس طراحی شده در انتهای َ۵ قطعه cDNA میانی به­دست آمده از مراحل قبلی، انجام گرفت (جدول ۳-۲). در این واکنش­ها، آغازگرهای خارجی و داخلی َ۵ موجود در کیت به عنوان آغازگر مستقیم استفاده شدند.
تمام محصولات حاصل از پروتوکل­های َ۳ و َ۵ در ژل آگارز ۱% اجرا شدند. باندهای دارای اندازه مورد انتظار جدا و تصفیه و به منظور توالی­یابی با بهره گرفتن از کیت کلونینگ توپو-تی.آ به داخل وکتورpCR®۴TOPO® کلون شدند.
در نهایت هر سه توالی cDNA بدست آمده (َ۳، میانی و َ۵) با توجه به ۱۰۰% شباهت در قسمت­ های دارای همپوشانی و با بهره گرفتن از یک ادغام کننده الگوریتمی (http://pro.genomics.purdue.edu/emboss/) به یکدیگر متصل شدند.
۳-۸-۸- تکثیر سریع دوانتهای cDNA در بتا-اکتین

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...