kH2po4

Merck, Germany

KCL

Merck, Germany

Ethanol 0/080

Merck, Germany

Ethanol 0/090

Merck, Germany

PorA

Cinnagen, Iran

۳-۳-روش کار
احیای استوک باکتری
در ابتدا باکتری لیوفلیزه نوترکیب porA احیا شد که در زیر روش احیا توضیح داده شده است.
احیای لیوفلیزه باکتری نوترکیب porA:
ویال لیوفلیزه، حاوی E.coliای است که داخل آن porA بصورت کلون شده وجود دارد.
مشخصه لیوفلیزه R2022 90/11/29
برای احیا کردن،سر ویال حاوی لیوفلیزه زیر هود حرارت داده شد و سپس با پنس استریل آنرا شکسته و بوسیله سمپلر۱ سی سی ازمحیط ال بی براث که ۵سی سی از آن آماده گردیده بود کشیده و داخل ویال حاوی لیوفلیزه برده شد و چند بار سوسپانسیون شد تا مواد کاملا حل گردد بعد از اینکه کامل سوسپانسیون شد محتوای ویال داخل بقیه محیط ال بی براث ریخته شد و روی شیکر انکوباتور۳۷درجه با دور۱۷۰تا۱۷۵ rpm به مدت چهار ساعت قرار گرفت تا باکتری رشد کند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

پس از آنکه باکتری رشد کرد روی محیط ال بی اگار از آن کشت پارویی داده شد و در انکوباتور ۳۷ درجه به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفت تا کلونی ها رشد کنند.لازم به ذکر است که محیط ال بی براث و ال بی اگار حاوی امپی سیلین است.
۳-۴ – رنگ امیزی گرم
بعد از ۲۴ ساعت که در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد باکتری مورد نظر رشد کرد وکلونی ها نمایان شد. ابتدا از کلنی باکتری موردنظر روی لام گستره ای تهیه کرده و گستره را خشک و سپس فیکس شد.سپس روی آن رنگ کریستال ویوله ریخته شد و بعد از یک دقیقه رنگ را خالی کرده و لام شسته شد بعد از آن روی گستره محلول لوگل ریخته و بعد از گذشت زمان یک دقیقه و تشکیل کمپلکس کریستال ویوله لوگل عمل رنگ بری با مخلوط الکل-استون انجام شد.در این مرحله اگر باکتری گرم مثبت باشد کمپلکس کریستال ویوله لوگل را از دست نمی دهد و بنفش می ماند ولی اگر گرم منفی باشد کمپلکس را از دست داده و بی رنگ می شود.مرحله بعد معرف رنگی سافرانین را اضافه کرده و بعد از ۳۰ تا ۶۰ ثانیه رنگ را خالی کرده و گستره با آب شسته شد. پس از غربالگری باکتری های میله ای گرم منفی در محیط ال بی آگار حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند.
۳-۵- طرز تهیه استوک:
از روی پلیت ال بی آگار حاوی باکتری مورد نظر،یک کلنی تک تازه (۱۶ تا ۲۴ ساعته) برداشته و به ۵میلی لیتر محلول ال بی براث استریل حاوی امپی سیلین تلقیح شد و به مدت ۳ الی ۴ ساعت با سرعت ۱۸۰ rpm در دمای ۳۷ درجه روی شیکر انکوباتور قرار گرفت تا در طول موج ۵۹۵ نانومتر به OD حدود ۵/۰ برسد. سپس، ۵میلی لیتر گلیسرول ۱۰۰ درصد استریل زیر هود به این لوله اضافه شد،پس از آنکه آن کاملاً هموژن شد در میکروتیوب­های ۵/۰میلی لیتر تقسیم گردید و سریعاً به فریزر ۲۰- درجه انتقال ­داده شد.
۳-۶- روش استخراج DNA پلاسمیدی
استخراج DNA پلاسمیدی طبق روش (سامبروک و همکاران-۲۰۰۱) ­با اندکی تغییرات و به صورت ذیل انجام پذیرفت :
۳-۶-۱ طرز تهیه محلول­های مورد نیاز برای استخراج پلاسمید
(( محلول شماره I ))

EDTA

Tris base

Glucose