• در محیط کشت جامد، توده کالوس در سطح محدودی با محیط کشت در تماس است، در نتیجه مواد کمتری از محیط کشت جذب می کند و تعادلی در رشد در اثر مواد غذایی جذب شده، گازهای تبادل شده و فرآورده های پس مانده سمی بین کالوسو محیط کشت وجود ندارد.

• در محیط کشت جامد تأمین اکسیژن کمتر از محیط کشت مایع است.

• توده های کالوس در محیط کشت مایع به قطعاتی تقسیم می شوند و در سطح بیشتری تولید می شوند، در نتیجه جذب مواد غذایی از محیط کشت افزایش می یابد که در محیط کشت جامد چنین نیست.

• در محیط کشت جامد، افزودنیهایی وجود دارد که باعث تسریع در تمایز می شوند و از رشد کالوس جلوگیری می کنند.

واکشت کالوس یعنی انتقال کالوس از یک محیط کشت به محیط کشت دیگر که به دلایل زیر صورت می گیرد:

• تجمع مواد زائد در محیط کشت.

• تخلیه مواد غذایی محیط کشت.

• خشک شدن محیط کشت.

معمولاً اگر دمای اتاق رشد حدود ۲۵ درجه سانتیگراد باشد هر ۶-۴ هفته یکبار لازم است کالوس به محیط جدید منتقل شود. کالوس ها پس از واکشتهای مکرر قادر به تأمین اکسین و سیتوکنین بوده و از این نظر خودکفا می شوند که به آن عادت کردن می گویند.
کالوسها از نظر رنگ و برخی صفات دیگر می توانند متفاوت باشند.کالوس ها از نظر رنگ به دو دسته تقسیم می شود: کالوس های تیره که دارای سایه های کرم، زرد، بژ یا قهوه ای می باشند و کالوسهای روشن که گاهی اوقات (نه همیشه) سبز هستند و ممکن است دارای رنگدانه های قرمز (آنتوسیانین) یا تیره (ترکیبات فنولی) باشند.
از نظر بافت نیز کالوس ها متفاوت بوده و برخی نرم و براحتی قابل جدا کردن هستند (کالوس هویج) و برخی سفت و محکم هستند (کالوس آنتوریوم). از نظرسرعت رشد نیز، کالوس ها متفاوتند و معمولاً بعد از گذشت یک تا چند هفته مقدار کالوس قابل مشاهده است. معمولاً مدت زمان دوبرابر شدن یک توده کالوس مستقر شده یک هفته یا بیشتر می باشد.
شاخص های متعددی برای ارزیابی کالوس ها وجود دارندکه از جمله آنها می توان به وزن تر، درصد وزن خشک، شمارش تعداد سلول، شاخص میتوزی کالوس و شاخص تنفس کالوس اشاره کرد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲-۴-۴- هورمونهای گیاهی
۲-۴-۴-۱- اکسین ها
اکسین برای القای رشد و طویل شدن در سلول و به شکل متداول برای ریشه زایی مورد استفاده قرار می گیرد.متداول ترین اکسین ها عبارتند از ۴،۲ دی کلرو فنوکسی استیک اسید (۲,۴-D)، نفتالین استیک اسید (NAA)، ایندول استیک اسید (IAA)، ایندول ۳- بوتیریک اسید (IBA).
IAA نوعی اکسین طبیعی است در حالی که ۲,۴-D، NAA و IBA اکسین های مصنوعی هستند.IAA در حضور نور به شدت تجزیه می شود در حالی که اکسین های مصنوعی به شدت پایدارند. دایکامبا^[۴۹]و پیکلورام^[۵۰] نیز اکسین های مصنوعی هستند. دایکامبا برای تک لپه ایها و پیکلورام برای بقولات استفاده می شود.
۲-۴-۴-۲- سیتوکنین ها
ترکیبات اکسین به طور متداول در ترکیب با سیتوکنین، یعنی گروهی از تنظیم کننده های رشد که تقسیم سلولی و ساقه زایی را تشدید می کنند، مورد استفاده قرار می گیرند. ایزوپنتیل آدنین، ۶ فوروفوریل آدنین که کینتین نیز نامیده می شود و بنزیل آدنین (BA) متداول ترین سیتوکنین ها در محیط کشت بافت گیاهی هستند. زئاتین و زئاتین ریبوزید دو سیتوکنین گران قیمت بوده و برای کشت های بافت گیاهی و سلولهای ویژه ای کاربرد دارند. تیدیازورون اخیراٌ با موفقیت برای پیشبرد باززایی گونه های چوبی مورد استفاده قرار گرفته است. با اعمال تغییراتی در نوع و غلظت نسبی اکسین ها و سیتوکنین ها در محیط کشت، امکان القای رشدهای تمایز نیافته و با ریخت زایی فراهم می گردد (Archana, G. 2002).
۲-۴-۴-۳- جیبرلین ها
جیبرلین ها طویل شدن ساقه را در چند گونه گیاهی تشدید می کنند و برای طویل شدن ساقه، پس از تشکیل جوانه در کشت بافت بعضی از گونه ها کاربرد دارد.
۲-۴-۴-۵- اسید آبسیزیک
اسید آبسیزیک بازدارنده رشد سلولی و القاگر خواب است اما احتمالاٌ تنظیم الگوی نموی را بر عهده دارد و نقش ویژه ای را در خلال مراحل اولیه جنین زایی رویشی ایفا می کند.
۲-۴-۴-۶- اتیلن
اتیلن ممکن است مانع رشد سلولی شود (Beyer, E. 1976) و روند پیری را در برخی کشت ها تسریع (Chen, D. 2000) و از تشکیل رویان جلوگیری می کند (Frame, B. 2000).
۲-۴-۵- اسیدهای آمینه، آگار، pHو منبع انرژی
در بین ترکیبات آلی که در محیط کشت به طور اختیاری اضافه می شوند اسیدهای آمینه برای افزایش رشد سلول و باززایی گیاه مورد استفاده قرار می گیرند (Beyer, E. 1976). محیط کشت MS می تواند حاوی گلایسین به عنوان یک منبع نیتروژنی احیایی باشد. گلوتامین نیز به عنوان تنها منبع نیتروژنی برای چند گونه گیاهی قابل استفاده است (Ghosh, B. 1997). آگار در غلظت های ۶/۰ تا ۸/۰ درصد به کار می رود و غلظت های بالاتر موجب کاهش وزن تر و خشک و میزان ساقه زایی در محیط های کشت می شود (Grant, J. 1991). تفاوت هایی که در جنین زایی مشاهده می شود می تواند ناشی از عوامل ژلاتینی و محیط مایع باشد. pH محیط معمولاٌ با HCl یا KOH تنظیم می گردد. اتوکلاو محیط عموماٌ آزادسازی قندهای اسیدی را در پی دارد که سبب نزول اندکی در pH محیط می شود (Hadarami, I. 1993).
متداول ترین منبع انرژی کربنی مورد استفاده در محیط های کشت سلول گیاهی ساکارز است اما گلوکز و فروکتوز هم مورد استفاده قرار می گیرند (Frame, et.al 2000).
۲-۴-۶- تمایز سلولی(Cytodifferentation)
سلولهای بافت کالوس طبیعت پارانشیمی دارند. در طی تمایز مجدد به یک گیاه کامل، این سلول ها بایستی به انواع مختلفی از سلول ها تمایز یابند. این تمایز مجدد در سلول ها به تمایز سلولی معروف است. در گیاه سالم تمایز بافت ها به روش ثابتی از خصوصیات اندام و گونه گیاه تداوم می یابد. معذالک کشت های کالوس از آنجا که فاقد عناصر آوندی هستند، برای مطالعه تأثیر انواع مواد شیمیایی و عوامل فیزیکی در تمایز بافت آوندی، سیستمی ارزشمند است. اکسین و ساکارز تأثیر عمده ای بر تمایز بافت های آوندی دارند، درحالیکه سیتوکنین ها و جیبرلین ها تمایز بافت آوند چوبی (Xylogenesis) را سرعت می بخشند. عموماٌ اکسین در غلظت پائین (۵/. میلی گرم در لیتر) تولید آوند چوبی را تحریک نموده و ارتباط معکوسی بین غلظت اکسین و میزان تمایز بافت آوند چوبی دارد. بعلاوه مشاهده شده است که تأثیر اکسیژن بر تمایز بافت آوندی به نحو تنگاتنگی به حضور قندها بستگی دارد. همچنین فاکتورهای فیزیکی نظیر دما و درجه حرارت تأثیر شناخته شده ای بر تمایز بافت آوندی دارد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).
۲-۴-۷- تمایز اندام
در طبیعت خاصیت توتی پوتنسی سلول های سوماتیکی در گیاهان مختلف دیده شده است. به طوریکه قطعات بزرگ ساقه و ریشه قادرند در اثر تمایز ساقه و ریشه تولید کنند. مطالعات در شرایط درون شیشه ای نشان داده است که خاصیت توتی پوتنسی به چند گونه اندک محدود نمی باشد و اغلب گونه های گیاهی اگر در شرایط مناسب قرار گیرند، تمایز نشان خواهند داد. برای باززایی یک گیاه کامل از یک سلول یا بافت کالوس، تمایز سلولی کفایت نمی کند و تمایز بایستی به شکل گیری جوانه ساقه یا جنین منجر شود. این امر با اندام زایی (Organogenesis) یا جنین زایی سوماتیکی تحقق می یابد. در اندام زایی، یک ساختار تک قطبی که متصل به بافت آوندی اولیه در درون کالوس است تشکیل می شود ولی در جنین زایی یک ساختار دو قطبی بدون هیچ گونه اتصال آوندی با بافتکالوس مادری یا ریزنمونه شکل می گیرد (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).
۲-۴-۷-۱- اندام زایی
در کشت بافت گیاهی اندام زایی فرایندی است که طی آن اندام های گیاهی نظیر ساقه، ریشه، جوانه گل و غیره تولید می شوند. این فرایند عبارت است از تولید اندام ها و جنین گیاهی (ساختارهای شبه جنین) از نقاطی غیرعادی نسبت به بافت مادری بر روی یک ریزنمونه سازمان یافته که فاقد هر سیستم از قبل تشکیل شده می باشد. ساقه ها و ریشه
های نابه جا از بافت هایی منشاء می گیرد که در حالت طبیعی این اندام ها را تولید نمی نمایند. ساقه های نابه جا ساختارهایی متشکل از ساقه و برگ هستند که از بافت های گیاهی در مکان هایی غیر از زاویه برگ منشاء می گیرند. نمو گیاه از طریق اندام زایی عبارت از تشکیل اندام ها با منشاء نابه جا یا منشاء مجدد می باشد. گیاه کامل باززایی شده با این روش، یک ساختار یک قطبی می باشد. این گیاه یک سری رشته های پروکامبیومی تولید می نماید که این رشته ها با شبکه آوندی موجود از قبل و گسترش یافته در بافت کالوس یا ریزنمونه کشت شده ارتباط برقرار می نماید.
فرایند اندام زایی از جنین زایی سوماتیکی متداول تر است و در تکثیر کلون به صورت انبوه پتانسیل خیلی بیشتری دارد و تولید گیاه به روش اندام زایی به دو طریق امکان پذیر است:

• اندام زایی از بافت کالوس با منشاء مجدد

• خروج اندام های نابه جا به طور مستقیم از ریزنمونه (فارسی، م. ج. ذولعلی. ۱۳۸۴).

۲-۴-۷-۲- اندام زایی از بافت کالوس
باززایی گیاه از ریزنمونه های کشت شده، مستلزم تولید کالوس های پایه و سپس تمایز جوانه ساقه از این بافت است. ایجاد ساقه، ریشه، گل آذین جوان، گلبرگ، جنین و … در شرایط درون شیشه ای صورت گرفته است. برای باززایی موفق گیاه در هر گونه و یا واریته معین ممکن است به ریزنمونه خاصی نیاز باشد. ریزنمونه های حاصل از اندام های بالغ و نابالغ را می توان در تهیه کالوس و سپس باززایی گیاه مورد استفاده قرار داد. با این حال معمولاٌ ریزنمونه های دارای سلول های فعال میتوزی، برای تولید کالوس مناسب تر هستند.
بافت ها و اندام های نابالغ در کشت درون شیشه ای از نظر مورفولوژیکی نسبت به بافت های بالغ انعطاف پذیرترند. اندازه و شکل ریزنمونه نیز مهم است.تعداد زیاد سلول در ریزنمونه های بزرگ تر، احتمال بدست آوردن یک کشت بادوام را افزایش می دهد. درصد کمی از سلول های ریزنمونه در تشکیل کالوس شرکت می نمایند. محل تشکیل کالوس معمولاٌ در سطح پیرامون ریزنمونه و یا در سطح بریده شده است. بافت کالوس در اثر ایجاد زخم و یا در پاسخ به هورمون های اضافه شده در محیط کشت ایجاد می شود.برای انتخاب ریزنمونه بایستی اندام های مریستمی نظیر نوک ساقه، جوانه جانبی، گل آذین، ساقه، برگ، دمبرگ و ریشه، بر سایر بافتها ترجیح داده می شود. چرا که این بافت ها دارای خصوصیات نظیر خصوصیات کلونی، بقاء کشت، سرعت رشد و خاصیت توتی پوتنسی در کشت های درون شیشه می باشد.مریستم ها، نوک ساقه و جوانه های جانبی، برگ ها و جنین های نابالغ، بویژه در غلات نیز ریز نمونه های خوبی هستند. ریزنمونه هایی نظیر برگ های بالغ، ریشه، ساقه، دمبرگ و اجزای گل، می توانند با موفقیت برای تولید گیاهچه به روش اندام زایی مورد استفاده قرار گیرند. فصل سال، سن و وضعیت فیزیولوژیکی گیاه والد نیز در موفقیت اندام زایی از کشت های سلولی سهیم اند. محیط کشت های مختلفی از جمله MS، B₅، وایت و محیط کشت SH برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند. محیط کشت MS بر خلاف محیط های دیگر، محتوی مقادیر زیادی نیتروژن آمونیومی می باشد.
در روش اندام زایی معمولاٌ از دو نوع کشت سلولی استفاده می شود:

• کشت توده های سلولی در سطح محیط کشت جامد

• کشت سوسپانسیون سلولی در محیط کشت مایع