طویل شدن

۷۲

۱

بسط نهایی

۷۲

۵

در ژن کاتالاز قطعات DNA حاصل از PCR190 جفت بازی می­باشند. پس از پایان PCR، به ۱۰ میکرولیتر از محصول PCR، ۲ میکرولیتر از بافر EcoRVو ۲۵/۰ میکرولیتر (معادل ۵ واحد) از آنزیم EcoRV اضافه کرده و لوله ها را به مدت ۱۶ ساعت در Hot plateدر دمای ۳۷درجه سانتیگراد قرار می­دهیم. پس از پایان این مدت زمان، نمونه­ها راخارج کرده، Spin down می­کنیم و به الکتروفورز منتقل می­کنیم. ژنوتیپ TT این چند­شکلی، جایگاهی برای برش توسط آنزیم EcoRV ندارد. بنابراین، باند ۱۹۰ جفت بازی نشان دهنده آلل موتانت این چند شکلی است. ژنوتیپ CC توسط آنزیم EcoRV برش خورده و دو قطعه ۱۵۷ و ۳۳ جفت بازی بوجود می ­آید. قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های این چند شکلی در جدول ۳-۶ نشان داده شده ­اند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

جدول ۳-۶: قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی CAT

ژنوتیپ

قطعات

TT

۱۹۰

CT

۳۳، ۱۵۷، ۱۹۰

CC

۱۵۷،۳۳

۳-۶ الکتروفورز
به منظور مشاهده قطعات DNA حاصل از هضم، جهت تعیین چندشکلی ژنتیکی CAT C-262TوNQO1 C609T، آن­ها را به ژل ۵/۱ % آگاروز منتقل می­کنیم. برای تهیه ژل ۵/۱ %، ۷۲/۱ گرم پودر آگاروز را با ۱۱۵ سی سی TBE 0.5x مخلوط کرده و با قرار دادن شانه درون ژل چاهک درست می­کنیم. پس از سرد شدن ژل و خارج کردن شانه مواد حاصل از هضم آنزیمی را با x Loading 6 مخلوط و به چاهک ها منتقل می­کنیم در یکی از چاهک­ها bp DNA Ladder100 به عنوان نشانگر طول قطعات می­ریزیم و با برقراری جریان الکتریکی قطعات DNA حاصل براساس اندازه خود در طول ژل از قطب منفی به مثبت دستگاه الکتروفورز حرکت کرده و از هم جدا می­شوند.
۳-۷ رنگ آمیزی ژل
به منظور اینکه قطعات DNA روی ژل آگاروز قابل رؤیت شود، ژل را از دستگاه الکتروفورز بیرون آورده و به مدت ۱۰الی ۱۵ دقیقه درون ظرف حاوی اتیدیوم بروماید (µg/ml1) قرار می­دهیم، پس از آن ژل را درون دستگاه Gel documentation قرار داده و با روشن کردن نور UV از آن عکس گرفته و مشاهده می­کنیم.
شکل ۳-۱: نتایج حاصل از PCR –RFLP چند شکلی ژنتیکی CAT C-262T
بر روی ژل آگاروز
شکل ۳-۲: نتایج حاصل از PCR -RFLP چند شکلی
ژنتیکی NQO1 C609T بر روی ژل آگاروز
۳-۷ تحلیل آماری
نتایج حاصل از مطالعه که برروی بیماران پیوند کبد و چند­شکلی ژن­های CAT وNQO1 انجام گرفت بانرم­افزار SPSS، با به کارگیری روش کای اسکور (x²) و آنالیز آماری رگرسیون لوجستیک و آزمون t-test با در نظر گرفتن سطح معنی­داری ٠۵/٠P< مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم.
فصل چهارم
نتایج