۳-۵-۷-۵- گرادیانت دمایی جهت بدست آوردن دمای اتصال برای Fim

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

در ابتدا قبل از شروع pcr برای بدست آوردن دمای اتصال گرادیانت دمایی انجام گردید، نمونه مورد نظر برای این کار نمونه شماره ۱۱ انتخاب گردید، دماهای انتخاب شده برای انجام گرادیانت دمایی به ترتیب عبارتند از۶۴ -۶۳-۶۲-۶۱-۶۰-۵۹ با هر دو پرایمر فوروارد و ریورس، سپس الکتروفورز انجام گردید و بعد از مشاهده باندها تصمیم گرفته شد که از دمای ۵۹ درجه در ژن Fim استفاده شود چون وضوح باند در هر دو پرایمر فوروارد و ریورس در این دما بیشتر بود برنامه دمایی مورد استفاده برای یک واکنش pcr برای ژن Fim در( جدول شماره ۳-۸)آمده است.
جدول ۳-۸: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Fim

مراحل PCR

دما برحسب درجه

زمان

تعداد چرخه

نام چرخه

واسرشت اولیه

C°۹۵

۵ دقیقه

۱
۳۰
۱

اول
دوم
سوم

واسرشت شدن

C°۹۴

۱ دقیقه

اتصال

C°۵۹

۱ دقیقه

گسترش

C°۷۲

۱ دقیقه

گسترش نهایی

C°۷۲

۷ دقیقه

. ۳-۶-مراحل انجام PCR
مرحله واسرشتی اولیه^۱: در این مرحله ابتدا با بهره گرفتن از حرارت دو رشته DNA از هم باز می شوند. مطابق با جدول دمای دناتوراسیون C°۹۵ و زمان مورد نیاز معمولاً ۵دقیقه است.
از این مرحله به بعد وارد برنامه چرخه ای PCR می شویم که خود شامل سه مرحله است:
مرحله واسرشتی^۲: این مرحله نیز مانند مرحله واسرشتی اولیه، اما با زمانی کوتاهتر از آن انجام می گیرد. دو رشته DNA بطور کامل در این مرحله از هم جدا می شوند. دمای مورد استفاده در این مرحله ۹۵درجه سلسیوس به مدت ۳۰ ثانیه است.
مرحله اتصال^۳ :در این مرحله با پایین آوردن دما و رساندن آن به حد مناسب تلاش می شود تا پرایمرها بتوانند با رشته مکمل خود در DNA الگو جفت شوند.
مرحله طویل شدن^۴: دما باید برای فعالیت آنزیم پلیمراز مناسب باشد و در این مرحله رشته مکمل رشته الگو ساخته خواهد شد و از آنجا که رشته های ساخته شده جدید نیز مکمل آغازگرها هستند، این چرخه حرارتی می تواند چندین بار تکرار شود و به همین طریق ساخت و تکثیر قطعات ادامه می یابد. دمای این مرحله ۷۲ درجه سلسیوس می باشد که برای فعالیت آنزیم پلیمراز مناسب است.^[۳۷]
۳-۶-۱-بهینه‌سازی PCR
بهینه‌سازی یعنی تعیین غلظت‌های مناسب مواد واکنشگر و دمای مناسب اتصال پرایمرها ™ جهت به دست آوردن محصول PCR مناسب برای این منظور برای هر یک از پارامترها مثلTm آزمایشات مختلف انجام شد سپس با بررسی محصول و نوع پرایمرها و نیز شرایط واکنش، بهترین دما و سیکل انتخاب گردید.
به منظور بدست آوردن دمای مناسب برای هر یک از پرایمرها جهت انجام واکنش PCR، نمونه کنترل مثبت را با یک جفت پرایمر گرادیانت دمایی گذاشتیم و دمای مناسب هر یک گزارش شد.
عمل بهینه نمودن واکنش با تغییرات جزء به جزء و مرحله به مرحله در غلظت‌های DNA الگو، پرایمر، dNTPs، MgCI2، polymerase DNA Taq و بهترین دمای Annealing صورت گرفت تا اینکه شرایط بهینه جهت تکثیر ژن‌های ویرولانس حاصل آمد.
۳-۶-۲- بررسی محصول PCR