استیک اسید Merck 10 میلی لیتر
مواد را مخلوط کرده پس از حل شدن کوماسی بلو، با آب مقطر به حجم رساندیم .
– محلول رنگ زدا Destaining Solution (100میلی لیتر)
اتانول ۹۶ پارسیان ۱۲ میلی لیتر (۱۲%)
استیک اسید Merck 7 میلی لیتر (۷%) با آب مقطر به حجم رساندیم .
روش کار :
ژل را برای مدت ۲ ساعت توام با شیکینگ در محلول کوماسی بلو غوطه ور نمودیم . پس از دو ساعت رنگ را تخلیه کرده و ژل را در محلول رنگ زدا گذاشتیم و تا ظهور کامل باندها زمان دادیم . در این فاصله در مواقع ضرور محلول رنگ زدا تجدید شد .

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

بیان پروتئین مورد نظر با مقایسه نمونه های BI و AI و تطابق باند اضافی در نمونه AI با شاخص وزن مولکولی محقق شد .
۳-۲-۲- تائید هویت پروتئین بیان شده با روش وسترن بلات
وسترن بلات یک روش بسیار سودمند برای تعیین هویت و همچنین تعیین مقدار یک پروتئین خاص در یک مخلوط پروتئینی می باشد . در این روش نمونه حل شده توسط دترجنتها ، بوسیله الکتروفورز روی ژل SDS – پلی آکریل آمید تفکیک شده آن گاه به کمک الکتروفورز به یک غشاء صلب که معمولا“ نیتروسلولز یا PVDF(polyvinylidene difluoride) می باشد ، منتقل می شود . پس از انتقال می توان غشاء را با رنگی همچون ponceau S رنگ کرده و از انتقال پروتئین مورد نظر (باند مورد نظر) اطمینان حاصل کرد . سپس غشاء در معرض آنتی بادی های اختصاصی برای پروتئین هدف قرار می گیرد . آنتی بادی اتصال یافته توسط آنتی بادی ثانویه ای که می تواند با یک رادیو ایزوتوپ مثل I نشاندار شده باشد یا حامل آنزیمی چون الکالاین فسفاتاز یا پراکسیداز باشد از طریق رادیوگرافی یا تولید آنزیماتیک یک محصول رنگی تشخیص داده می شود . همچنین می توان از روش کمی لومینسنس (Chemiluminecanse) بعد از افرودن آنتی بادی کونژوگه استفاده کرد. بدین منظور بعد از انکوبه کردن غشاء با آنتی بادی کونژوگه با پراکسیداز ، از سوبسترایی استفاده می شود که در حضور پراکسیداز ، تبدیل به یک ماده نورزا می شود.
مواد و وسایل مورد نیاز برای وسترن بلات
محلول های لازم برای تهیه ژل پلی آکریل آمید
ژل پلی آکریل آمید کوچک (۱۲%)
Resolving برای یک ژل
میکس آکریل آمید ۳۰% Sigma 2 میلی لیتر
تریس هیدروکلراید (۸/۸ = pH) 3/1 میلی لیتر
آب مقطر ۶/۱ میلی لیتر
APS (10%) Sigma 50 میکرولیتر
TEMED Merck 2 میکرولیتر
Stacking برای یک ژل
میکس آکریل آمید ۳۰% Sigma 33/0 میلی لیتر
تریس هیدروکلراید (۸/۶= pH) 25/0 میلی لیتر
آب مقطر ۴/۱ میلی لیتر
APS (10%) Sigma 20 میکرولیتر
TEMED Merck 2 میکرولیتر
– بافر انتقال Transfer buffer (1200میلی لیتر)(PH:7.4)
Tris- base Sigma 3 گرم
Glycine Sigma 3/14 گرم
متانول Merck 200 میلی لیتر
تریس و گلایسین در یک لیتر آب حل شده آنگاه متانول اضافه شده و در ºC4 نگهداری گردید.
– بافر X 10 TBS ، ۴/۷ = pH(500میلی لیتر)
HCl – Tris Sigma 05/6 گرم (۱۰ میلی مولار)
NaCl Merck 8/43 گرم (۱۵ میلی مولار)
در آب مقطر حل شده و پس از تنظیم pH به حجم رسانده شد.
بافر شستشو : Washing buffer(100میلی لیتر)
X10 TBS (4/7 = pH) 10 میلی لیتر
Tween 20 100 میکرولیتر (۱/۰ درصد)
در آب مقطر حل شده به حجم رسانده می شود .
– بافر بلوک کننده Blocking buffer(100 میکرولیتر)
X10 TBS (4/7 = pH) 10 میلی لیتر
Tween 20 100 میکرولیتر (۱/۰ درصد)
BSA 5/2 گرم (۵/۲ درصد)
در آب مقطر حل شده به حجم رسانده شد .
– رنگ Ponceau S (100 میلی لیتر)
Panceau S Sigma (2 درصد)
تری کلرو استیک Merck (3 درصد)
سولفوسالیسیلیک اسید Merck (2 درصد)
در آب مقطر مخلوط و به حجم رسانده شد .
– منوکلونال آنتی بادی علیه Tg17-179 GRA7
– آنتی بادی کنژوگه با پراکسیداز Sigma
– غشاء PVDF(polyvinylidene difluoride) Schleicher & Schuell
– قالب و تانک الکتروفورز Biorad
– تانک الکتروفورز مخصوص بلات و قالبها و غشاءهای تراوا Biorad
– Rocker و stirrer
روش کار
۱- دو عدد ژل آکریل آمید کوچک با ترکیبات فوق الذکر و مطابق با روش کار آماده شد.
۲- از نمونه های BI و AI متعلق به کلنی های واجد قطعه GRA7 و فاقد آن همچنین از شاخص وزن مولکولی با غلظت مناسب روی ژل برده شد .