۲-۵ اندازه گیری پروتئین های محلول
برای اندازه گیری پروتئین‌های محلول از روش Bradford (1976) استفاده شد. اساس این روش در اتصال رنگ کوماسی بلو به صورت الکترواستاتیک به پروتئین می باشد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۵-۱ استخراج پروتئین
استخراج پروتئین ها در هاون های چینی و تمامی مراحل در دمای حدود ۰-۴ درجه ی سانتیگراد انجام شدند. به این منظور ابتدا ۱/۰ گرم بافت تازه گیاه وزن شده و با بافر استخراج در هاون سائیده شد(با نسبت ۱ به ۳ : ۱گرم بافت با ۳ حجم بافر استخراج). سپس عصاره ها به اپندورف منتقل شده و به مدت ۲۰ دقیقه در rpm 14000 و C ̊ ۴ سانتریفیوژ گردیدند. سپس محلول رویی جدا و به اپندورف های جدید منتقل شد. تمام مراحل کار بر روی یخ انجام شد.
۲-۵-۲ تهیه بافر استخراج پروتئین
این بافر متشکل از ۲ محلول مادر A و B می باشد که به صورت زیر آماده می شوند :
محلول استوک A : 78/2 گرم سدیم فسفات مونو بازیک (NaH2PO4) در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل گردد.
محلول استوک B : 306/5 گرم سدیم فسفات دی بازیک (Na2HPO4) در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل گردد.
۵/۸ میلی لیتر از محلول استوک A با ۵/۹۱ میلی لیتر از محلول استوک B مخلوط شد و سپس مواد زیر در آن حل گردید.
PVP(2٪)، گلیسرول(۱۰٪)، Na2EDTA(1 میلی مولار) و DTT(4 میلی مولار).
pH بافر به ۸/۷ رسید و حجم آن بوسیله آب مقطر به ۲۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
۲-۵-۳ اندازه گیری پروتئین
به منظور اندازه گیری پروتئین در یک لوله آزمایش ۱۰۰ میکرولیتر از عصاره مورد نظر منتقل شده و به آن ۵ میلی لیتر معرف برادفورد اضافه شد. مجموعه فوق به مدت ۲ دقیقه ورتکس شده و پس از گذشت ۲۰ دقیقه با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفتومتر(UV-160 Shimadzu) جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر خوانده شد.
نمونه بلانک حاوی ۱۰۰ میکرولیتر آب مقطر و ۵ میلی لیتر معرف برادفورد است.
۲-۵-۴ تهیه معرف برادفورد
برای تهیه معرف برادفورد ابتدا مقدار ۱۰۰ میلی گرم از کوماسی بریلیانت بلوG-250 در ۵۰ میلی لیتر اتانول ۹۵% کاملا حل شده و به آن ۱۰۰ میلی لیتر اسید فسفریک ۸۵% افزوده شد. حجم نهایی توسط آب مقطر به ۱۰۰۰ میلی لیتر رسید. سپس محلول حاصل توسط کاغذ صافی واتمن شماره ۱ صاف شد(این معرف بایستی در C° ۴ و در تاریکی نگهداری شود).
۲-۵-۵ رسم منحنی استاندارد
برای تهیه منحنی استاندارد از محلول سرم آلبومین با غلظت ۱ میلی گرم در میلی لیتر استفاده شد. به درون هر لوله آزمایش به ترتیب مقادیر ۰، ۲۰، ۴۰، ۶۰، ۸۰ و ۱۰۰ میکرولیتر محلول سرم آلبومین (میلی لیتر/ ۱میلی گرم) که به ترتیب حاوی ۰، ۲۰، ۴۰، ۶۰، ۸۰ و ۱۰۰ میکروگرم آلبومین بودند اضافه شد. در نهایت حجم لوله ها توسط آب مقطر به ۱۰۰ میکرولیتر رسانده شد. لوله آزمایشی که فقط حاوی ۱۰۰ میکرولیتر آب مقطر بود به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. سپس با بهره گرفتن از مقادیر مختلف جذب بدست آمده به ازای مقادیر مختلف پروتئین در طول موج ۵۹۵ نانومتر منحنی استاندارد رسم گردید(پیوست شماره ی ۷).
جدول ۲-۲ طرز تهیه ی نمودار استاندارد پروتئین

شماره لوله آزمایش
مقدار محلول آلبومین (میکرولیتر)
آب مقطر (میکرولیتر)
معرف برادفورد (میلی لیتر)
جذب ۵۹۵ نانومتر

۱
۰
۱۰۰
۵
۰

۲
۲۰
۸۰
۵
۲۰۹/۰

۳
۴۰
۶۰
۵
۳۶۵/۰