۱۵sec

۱٫۶ Kv

POP4

شکل ۲-۳ دستگاه الکتروفورز موئینه ای(۵۱)
۲-۵-۲-۳ روش جداسازی قطعات
در این تحقیق از GS 500 LIZ به عنوان سایز استاندارد استفاده شد.
۲/۰ ماکرولیتر LIZ استاندارد، ۹ ماکرولیتر Hi-Di formamaide و ۸/۰ ماکرولیتر محصول PCR مخلوط شده و به مدت ۵ دقیقه در دمای C°۹۵ قرار گرفت تا دناتوراسیون صورت گیرد، چنانچه این مرحله حذف شود بعضی از توالی‌ها که حاوی گوانین و سیتوزین زیادی هستند، ممکن است دو رشته‌ای باقی بمانند در حالی که سایر توالی‌ها می‌توانند دناتوره شوند و یک پیک نرمال ایجاد کنند. قطعات دو رشته‌ای، در الکتروفورز به شکلی غیر معمول حرکت می‌کنند. سپس دما را به C°۴ رسانده و محتویات هر ویال (۱۰ ماکرولیتر) درون چاهک‌های مخصوص بشقاب تزریق دستگاه ریخته و در آن بسته شد. بشقاب تزریق را در مکان مخصوص خود درون دستگاه الکتروفورز قرار گرفت و دستگاه روشن شد. زمانی که الکتروفورز در حال انجام است، نمونه‌های موجود در بشقاب تزریق در انتهای آند (قطب منفی) دستگاه، به درون لوله های موئین تزریق می‌شوند. سپس لوله های موئین به درون بافر آند انتقال می‌یابند. انتهای کاتد دستگاه، حاوی یک اتاقک بافر است که دارای یک پمپ جهت ارسال پلیمر تازه به داخل لوله های موئین است. قطعات جدا شده با فلورسنت نشان‌دار شده‌اند و در اثر برخورد اشعه‌ی لیزر به آن‌ها، برانگیخته می‌گردند. سپس قطعات برانگیخته شده، انرژی خود را به فلورسانس آزاد می‌کنند که توسط یک آشکار ساز در انتهای کاتد دستگاه آشکار می‌گردند. پیک‌های حاصل از این آشکارسازی را می‌توان توسط نرم افزار مشاهده نمود.
شکل۲-۴ چگونگی عملکرد دستگاه الکتروفورز موئینه ای(۲۶)
۲-۶ آنالیز داده ها
در این مطالعه از نرم افزار GeneScan Analysis 3.1 به منظور مطالعه و آنالیز داده‌های خام استفاده شد.
کیت IDENTIFILER از یک سیستم ۵ رنگ فلورسنت برای تجزیه و تحلیل قطعات DNA استفاده می‌کند . PET,LIZ,VIC,NED و۶-FAM، نشان‌گرهای فلورسنتی هستند که در هر کدام دارای رنگ‌های مختلفی بوده و در اینجا کاربرد دارند. از پنج رنگ مذکور، چهار رنگ PET,VIC,NEDو ۶-FAM به منظور رنگ آمیزی نمونه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند و از رنگ لیز به عنوان یک سایز استاندارد استفاده می‌شود. هر کدام از این رنگ‌ها حداکثر نور خود را در طول موج های مختلفی ساطع می‌کنند. آنالیزی که بدین طریق اتجام می‌گیرد آنالیز چندجزئی می‌باشد.

جدول ۲-۶ مواد فلورسنت موجود در کیت ABI و رنگ‌هایشان

رنگ

نام

آبی

۶-FAM

سبز

VIC

زرد

NED

قرمز

PET

نارنجی

LIZ

شکل۲-۵ مواد مختلف در طول موج های متفاوتی نور خود را ساطع می کنند(۲۶)
در حقیقت برای آنالیز نمونه‌ها از یک نردبان آللی استفاده می‌شود، که در آن جایگاه‌ها بر اساس سایز و به کمک ۴ رنگ مذکور دسته بندی شده‌اند. در هر جایگاه کلیه آلل‌هایی که ممکن است در آن لوکوس موجود باشند، نمایش داده می‌شوند.
جدول ۲-۷ ماده فلورسنت مورد استفاده برای هر جایگاه(۲۵)