Serotype

L1(Accession)

L2(Accession)

Importance

HPV type 11

CCB84764

CCB84763

High prevalent/moderate risk

HPV type 16

AAV91691

AAO85414

High risk

HPV type 18

AAP20601

AGU90429

High risk

HPV type 31

AEI61093

AEI61092

High risk

HPV type 45

AGU90648

AGU90647

High risk

جدول۳-۱: سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۲-پیش بینی اپی توپ سلول B

برای پیش بینی مناطق اپی توپ در پروتئین های L1 و L2، از سرور BCRPEDS بر اساس نقایص توصیه شده استفاده شد. این سرور سبب می شود کاربر سنجش مدل سازی را در بین سه روش پیش بینی موجود انتخاب کند: ۱) روش AAP، ۲) BCPred؛ ۳) FBCred. در سنجش پیش بینی ما، روش BCPred انتخاب شد، زیرا می توان در آن طول اپی توپ مورد نظر را انتخاب کرد و همچنین دارای اختصاصیت ارائه توالی آنتی ژنی می باشد. انتخاب اپی توپ با طول ثابت پپتید ۲۰ mers بوده است.

۳-۳-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال

بعد از انتخاب اپی توپ ها، در مرحله بعد از نظر میزان از قابلیت دسترسی به حلال بررسی شدند. سطح یک پروتئین می تواند بطور احتمالی با آب در تماس باشد و آن منطقۀ اتم روی سطح که بوسیله آب در تماس است، سطح مولکول قابل دسترس یا منطقۀ در معرضِ حلال نامیده می شود. بنابراین انتخاب اپی توپ های با میزان بالاتر قابلیت دسترسی به حلال توصیه می شوند. بدین منظور، به ساختمان پروتئین های L1 و L2 نیاز بود. ساختمان های کریستال پروتئین L1 و L2 قبلاً تعیین شدند. برای کسب مدل ساختمانی سه بعدی پروتئین های L1، ساختمان کریستال این پروتئین ها به عنوان قالب PDB در سرور مدل سازی پروتئین رباط Swiss Model Alignment بکار برده شد (۲۲۰). ساختمان کریستال L1 HPV 11 برای L1 HPV11، ساختمان کریستال L1 HPV 16 برای L1 HPV 16، ساختمان کریستال L1 HPV 18 برای L1 HPV 18، ساختمان کریستال L1 HPV 31 برای L1 HPV 31 و ساختمان کریستال L1 HPV 45 برای L1 HPV 45 استفاده شد. علارغم در اختیار داشتن توالی پروتئین های L2 به علت در دسترس نبودن ساختمان کریستال این پروتئین ها در قالب PDB، مدل های ساختمان سه بعدی L2 بدست نیامدند. تناسب بین مدل های ساختمان سه بعدی در SWISS-PDB Viewer توسط محاسبۀ میانگین انحراف مربع ریشه یا جذر بعد از تناسب بندی تکراری ارزیابی شد. بعد از آماده سازی ساختمان ها، قابلیت دسترسی این اپی توپ ها به حلال در نرم افزار spdbv مورد مطالعه قرار گرفت. در نهایت، اپی توپ هایی با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال انتخاب شدند.

۳-۴-محل های N-Glycosylated

زنجیره های کربوهیدرات در N-Glycosylation به نیتروژن آسپاراژین متصل می شوند و عملکردهای مختلفی را در بر دارند. گلیکوزیلاسیون متصل به N شایع ترین نوع پیوند گلیکوزیدی است و برای چین خوردن بعضی از پروتئین های یوکاریوتیک اهمیت دارد و در یوکاریوتیک ها رخ می دهد اما در باکتری ها نادر است. بدین منظور بیان نهایی تولید پروتئین در اشرشیا کولی طراحی شد، بنابراین حذف اپی توپ هایی که محل های N-Glycosylated دارند، ضروری است. برای پیش بینی محل های N-Glycosylated، سرور ensemblegly –Iowa مورد استفاده قرار گرفت. اپی توپ های انتخاب شده از مرحله قبلی در سرور ensembelgly –Iowa مورد انالیز قرار گرفتند و توالی هایی که حتی یک محل N-Glycosylated داشتند در طرح ساختار نهایی حذف شدند.

۳-۵-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان

بعد از انتخاب بهترین اپی توپ های آنالیز بیوانفورماتیک مبتنی بر L1 و L2، این اپی توپ ها به یکدیگر متصل شدند و اولین ساختمان این ساختار بوسیله سرور Lasergene Seqbuilder ساخته شد. ساختار نهایی با بهره گرفتن از ابزار ترجمۀ معکوس Sequence Manipulation Suite (http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html) ترجمه شد.Sequence Manipulation Suite یک مجموعه از برنامه های JavaScript برای آنالیز توالی های پروتئینی و DNA کوتاه است. در این سرور، ترجمۀ معکوس یک توالی پروتئینی را قبول می کند، یک جدول کاربرد کدون را برای ایجاد توالی DNA نمایش می دهد و یک توالی از همه کدون های احتمالی برای ترجمه معکوس هر اسیدآمینه به اسیدنوکلئیک را ارائه می دهد.

۳-۶-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon)

بهینه سازی کدون تکنیکی است که از کارایی حامل های بیان DNA که در واکسیناسیون DNA برای کسب بیان بهینۀ ژن خارجی در جسم سلول میزبان استفاده می شود، حمایت می کند (۲۲۱) . ساختارهای بهینه شده با بهره گرفتن از ابزار OPTIMIZER در سرور ژنوم که کدون مطلوب معادل با هر اسید آمینه را ارزیابی می کنند، بوسیله DNA و تعویض کدون ها کدگذاری می شوند. OPTIMIZER یک وسیله PHP on line است که کاربرد کدون یک توالی DNA را برای افزایش سطح بیان آن بهینه سازی می کند. کاربرها می توانند جداول ارجح خود را برای استفاده در فرایند بهینه سازی معرفی کنند یا از جداول از پیش تعیین شده بیشتر از ۱۵۰ گونه پروکاریوتیک تحت انتخاب با ترجمه ایی قوی استفاده کنند. این سرور می تواند برای پیش بینی و بهینه سازی بیان سطح یک ژن در بیان ژن هترولوگ با مطلوب ترین کدون مفید باشد. ارزشیابی ساختار نهایی برای آنالیز کدون نادر برای تشدید سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین یک مرحله بسیار مهم است. به این منظور، از ابزارهای آنالیز rare codon در سرور GenScript استفاده شد. این ابزار توالی DNA کدگذاری پروتئین مورد نظر را می خواند و خصوصیات مربوط به ارگانیسم آن را محاسبه می کند، این نرم افزار همچنین قابلیت تعیین CAI (شاخص انطباق کدون)، محتوای GC و توزیع فراوانی کدون را دارد. این اطلاعات برای پیش بینی این مسئله که ژن ساختمان نهایی در اشرشیا کولی به خوبی بیان خواهد شد، بسیار مفید است. CAI برای ساختمان ارتقا یافته در بهترین حالت بیان، به بالاتر از ۰٫۸ می رسد.

۳-۷-تولید ساختار واکسن

آنالیز نهایی ساختار واکسن مشتمل بر ۲۰ اپی توپ ۲۰ اسیدامینه ای حاوی ۴۰۰ اسید آمینه که بعد از ترجمه معکوس به صورت ۱۲۰۰ اسیدنوکلئیک در نظر گرفته شد شامل درصد احتمالی قرارگیری ساختار فوق در سطح سلول، منطقۀ آلفا آلفاتیک و بتا آلفاتیک، ترجمۀ توالی آنتی ژنیک، شاخص آنتی ژنی سیتی و پیش بینی میل ترکیبی پیوند به صورت آخرین نقطه کنترل برای اعتبارسنجی و اطمینان پذیری با روش hopp و woods در ابزار Expasy اندازه گیری شدند. نرم افزار آنزیم برش گر BamHI را برای برش ابتدای توالی و آنزیم برش گر HindIII را برای برش انتهای توالی انتخاب گردید. بنابراین، کدون آغازین ATG و توالی GGATCC (کدون BamHI) در آمینوترمینال ساختمان نهایی وارد شدند و همچنین توالی AAGCTT (کدون HindIII) نیز در کربوکسیل انتهایی وارد شد. در نهایت آنها به همدیگر متصل شدند و توالی مشاهده شد. در مرحلۀ نهایی، حامل pET28a به عنوان یک وکتور بیان پلاسمید برای ساختن واکسن مبتنی بر مولتی اپی توپ انتخاب شد. سیستم بیان p ET یکی از گسترده ترین سیستم های مورد استفاده برای کلونینگ و بیان پروتئین های نوترکیب در اشرشیا کولی در محیط آزمایشگاه است.