1. رنگ DCFH-DA با غلظت 10ميلي­مولار درDMSO بدون آب و رنگ DHE با غلظت 25/1 ميکرومولار در اتانل ساخته شد.
    1. يک ميکروليتر از رنگ DCFH-DA در 999 ميکروليتر PBS حل شد و 10-15 ثانيه ورتکس شد.
    1. رنگ بالا به همراه 25/1 ميکروليتر رنگ DHE به حدود يک ميليون سلول اضافه شد و سلول‌ها در 37 درجه سانتيگراد به مدت 15 دقيقه انکوبه شدند.
    1. سلول‌ها سه بار با PBS شستشو شدند و ميزان راديکال­هاي آزاد با دستگاه فلوسايتومتري خوانده شد(Mahfouz, Sharma, Lackner, Aziz, & Agarwal, 2009).

3-7- روش­ها­ی تعیین آسیب DNA اسپرم
سلامت ژنتیکی اسپرم برای لقاح و تکامل جنین ضروری است. مطالعات بسیاری، آسیب DNA در اسپرم را بررسی و ارتباط آن را با ناباروری مردان گزارش نموده ­اند.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

آسیب DNA اسپرم را می­توان به طور مستقیم (فراگمنتاسیون) و یا به طور غیر مستقیم (تراکم کروماتین اسپرم) مورد ارزیابی قرار داد. آسیب DNA اسپرم را می­توان به طور مستقیم توسط تکنیک­های [49]COMET[50], TUNEL و یا SCD[51] که در آن­ها فراگمنتاسیون DNA اندازه ­گیری می­ شود، بررسی نمود.
آسیب DNA اسپرم را همچنین می­توان به طور غیر مستقیم به وسیله آزمون­های بررسی تراکم[52] کروماتین اسپرم و یا با ارزیابی سطوح پروتئین­های هسته­ای بررسی نمود. در آزمون­های بررسی تراکم کروماتین اسپرم، پروتئین­های هسته­ای مورد رنگ­آمیزی قرار می­گیرندTamburrino et al., 2011.
شکل (3-3) روش­های ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آن­ها. روش SCSA قابل تشخیص با دستگاه فلوسایتومتری .روش­های SCS,AOT,COMET,ISNT قابل تشخیص با میکروسکوپ فلورسنت در روش TUNEL هم از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری می­توان استفاده کرد(Tamburrino et al., 2012).
جهت تشخیص آسیب DNAبا توجه به نوع تست، می­توان از میکروسکوپ فلورسنت[53] یا دستگاه فلوسایتومتری[54] استفاده کرد(Agarwal & Said, 2004).
3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست DNAاسپرم
اين آزمون اولين بار توسط Gorczica و همکاران در سال 1993 انجام گرفت وبرای تشخیص میزان آسیب در دورشته­ی DNAکاربرد دارد. در این روش شکست­ها در یک یا دو رشته DNA قابل تشخیص است. پایانه ­های DNAفراگمنته شده، تك رشته و دو رشتهDNA توسط نوكلئوتيد­هاي نشاندار شده، و مورد هدف قرار مي­گيرند(Agarwal & Said, 2004). این واكنش توسط يك پايانه ترانسفرازي كاتاليز مي­شود. اين آنزيم، دي­اكسي­يوريدين تغيير يافته را با بيوتين يا ديگوكسي­ژنين(digoxigenin) درپایانه 3´OHاز رشته­اي كه شكسته شده است، تركيب مي­کند. سپس نوكلئوتيد­هاي تغيير يافته که متصل به فلورسنت می­باشد نمایان می­گردند. نوكلئوتيد به طور مستقيم با فلئوكروم نشاندار می­ شود. رنگ فلورسنت مشاهده شده در هر اسپرم، نشانگر افزايش تعداد شكستگي­هايDNA است. درصد اسپرم­هاي رنگ گرفته بيانگر ميزان آسيب DNA اسپرم است. براي تشخيص اسپرم­هاي آسيب ديده مي­توان از دو روش مشاهده با ميكروسكوپ فلورسنت یا دستگاه فلوسايتومتري استفاده كرد.
شکل (3-4): اساس روش TUNEL(Sharma, Masaki, & Agarwal, 2013)
3-7-2- جمع‌آوري سلول‌هاي اسپرمي جهت آنالیز شکست­های DNA اسپرم
ناحيه انتهايي اپيديديم جدا شده و پس از ايجاد چندين برش عرضي در آن، به مدت20-15دقيقه در يک ميلي ليتر محيطTCM ،%10 (جدول 3-1) حاوي 10 درصد FBS[55] درون انکوباتور C̊37 در حضور 5% CO2 و 90% رطوبت قرار گرفت(Krause, 1995).
بعد از گذشت 45 دقیقه، کل محلول رویی را کشیده و 7 دقیقه، 1200rpm سانتریفوژ کرده و به رسوب HTF[56]، 10% (جدول 3-2)افزوده و تا زمان تست DFI در تانک ازت نگهداری شد.
جدول (3-1): ترکيب محيط TCM

100 میلی لیتر

TCM

033/0 گرم

پیروات

01/0 گرم

استرادیول

6./0 میلی­گرم

پنی سیلین جی

05/0 میلی­گرم

استرپتومایسین

98/0گرم

مدیوم 199

22/0میلی­گرم

سدیم بی کربنات

تا حجم 100 میلی لیتر

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...