فایل شماره 5642 |
-
- رنگ DCFH-DA با غلظت 10ميليمولار درDMSO بدون آب و رنگ DHE با غلظت 25/1 ميکرومولار در اتانل ساخته شد.
-
- يک ميکروليتر از رنگ DCFH-DA در 999 ميکروليتر PBS حل شد و 10-15 ثانيه ورتکس شد.
-
- رنگ بالا به همراه 25/1 ميکروليتر رنگ DHE به حدود يک ميليون سلول اضافه شد و سلولها در 37 درجه سانتيگراد به مدت 15 دقيقه انکوبه شدند.
-
- سلولها سه بار با PBS شستشو شدند و ميزان راديکالهاي آزاد با دستگاه فلوسايتومتري خوانده شد(Mahfouz, Sharma, Lackner, Aziz, & Agarwal, 2009).
3-7- روشهای تعیین آسیب DNA اسپرم
سلامت ژنتیکی اسپرم برای لقاح و تکامل جنین ضروری است. مطالعات بسیاری، آسیب DNA در اسپرم را بررسی و ارتباط آن را با ناباروری مردان گزارش نموده اند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
آسیب DNA اسپرم را میتوان به طور مستقیم (فراگمنتاسیون) و یا به طور غیر مستقیم (تراکم کروماتین اسپرم) مورد ارزیابی قرار داد. آسیب DNA اسپرم را میتوان به طور مستقیم توسط تکنیکهای [49]COMET[50], TUNEL و یا SCD[51] که در آنها فراگمنتاسیون DNA اندازه گیری می شود، بررسی نمود.
آسیب DNA اسپرم را همچنین میتوان به طور غیر مستقیم به وسیله آزمونهای بررسی تراکم[52] کروماتین اسپرم و یا با ارزیابی سطوح پروتئینهای هستهای بررسی نمود. در آزمونهای بررسی تراکم کروماتین اسپرم، پروتئینهای هستهای مورد رنگآمیزی قرار میگیرندTamburrino et al., 2011.
شکل (3-3) روشهای ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آنها. روش SCSA قابل تشخیص با دستگاه فلوسایتومتری .روشهای SCS,AOT,COMET,ISNT قابل تشخیص با میکروسکوپ فلورسنت در روش TUNEL هم از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری میتوان استفاده کرد(Tamburrino et al., 2012).
جهت تشخیص آسیب DNAبا توجه به نوع تست، میتوان از میکروسکوپ فلورسنت[53] یا دستگاه فلوسایتومتری[54] استفاده کرد(Agarwal & Said, 2004).
3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست DNAاسپرم
اين آزمون اولين بار توسط Gorczica و همکاران در سال 1993 انجام گرفت وبرای تشخیص میزان آسیب در دورشتهی DNAکاربرد دارد. در این روش شکستها در یک یا دو رشته DNA قابل تشخیص است. پایانه های DNAفراگمنته شده، تك رشته و دو رشتهDNA توسط نوكلئوتيدهاي نشاندار شده، و مورد هدف قرار ميگيرند(Agarwal & Said, 2004). این واكنش توسط يك پايانه ترانسفرازي كاتاليز ميشود. اين آنزيم، دياكسييوريدين تغيير يافته را با بيوتين يا ديگوكسيژنين(digoxigenin) درپایانه 3´OHاز رشتهاي كه شكسته شده است، تركيب ميکند. سپس نوكلئوتيدهاي تغيير يافته که متصل به فلورسنت میباشد نمایان میگردند. نوكلئوتيد به طور مستقيم با فلئوكروم نشاندار می شود. رنگ فلورسنت مشاهده شده در هر اسپرم، نشانگر افزايش تعداد شكستگيهايDNA است. درصد اسپرمهاي رنگ گرفته بيانگر ميزان آسيب DNA اسپرم است. براي تشخيص اسپرمهاي آسيب ديده ميتوان از دو روش مشاهده با ميكروسكوپ فلورسنت یا دستگاه فلوسايتومتري استفاده كرد.
شکل (3-4): اساس روش TUNEL(Sharma, Masaki, & Agarwal, 2013)
3-7-2- جمعآوري سلولهاي اسپرمي جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم
ناحيه انتهايي اپيديديم جدا شده و پس از ايجاد چندين برش عرضي در آن، به مدت20-15دقيقه در يک ميلي ليتر محيطTCM ،%10 (جدول 3-1) حاوي 10 درصد FBS[55] درون انکوباتور C̊37 در حضور 5% CO2 و 90% رطوبت قرار گرفت(Krause, 1995).
بعد از گذشت 45 دقیقه، کل محلول رویی را کشیده و 7 دقیقه، 1200rpm سانتریفوژ کرده و به رسوب HTF[56]، 10% (جدول 3-2)افزوده و تا زمان تست DFI در تانک ازت نگهداری شد.
جدول (3-1): ترکيب محيط TCM
100 میلی لیتر
TCM
033/0 گرم
پیروات
01/0 گرم
استرادیول
6./0 میلیگرم
پنی سیلین جی
05/0 میلیگرم
استرپتومایسین
98/0گرم
مدیوم 199
22/0میلیگرم
سدیم بی کربنات
تا حجم 100 میلی لیتر
فرم در حال بارگذاری ...
[یکشنبه 1401-04-05] [ 08:56:00 ب.ظ ]
|