بر اساس تحقیقات به عمل آمده از جمله مخمرهای پروبیوتیک می­توان به جنس Saccharomyces اشاره داشت. گونه­ های Saccharomyces boulardii و Saccharomyces cerevisiae بعنوان پروبیوتیک معرفی شده اند (Gatesoupe , 2007).
۱-۴ بخش چهارم: ماهی قزل­آلا
۱-۴-۱ تاریخچه پرورش ماهی قزل­آلای رنگین کمان
اگر چه نظریاتی وجود دارد که نشان می­دهد پرورش ماهی قزل­آلا را نخستین بار سرخ پوستان آمریکا با انتقال تخم­های لقاح یافته از یک رودخانه به مراکز اولیه پرورش آغاز نمودند ولی با این وجود ماهی قزل­آلای رنگین کمان[۲۱]و فرم مهاجر آن، قزل­آلای سر فولادی[۲۲] از زیستگاه طبیعی خود یعنی نیمه غربی آمریکای شمالی به تمام نقاط جهان منتقل شده است (فروزانفر،۱۳۸۴ )، سپس در مدت کوتاهی بعد از جنگ جهانی دوم، اولین مزرعه پرورش ماهی قزل­آلای رنگین کمان در دره هگرمن[۲۳] ایالت آیداهو[۲۴] در آمریکا تاسیس شد (Stickney , 2001). شروع پرورش ماهی قزل­آلای رنگین کمان در مقیاس وسیع­تر به سال۱۹۳۰ در اروپا برمی­گردد که در استخرهای خاکی دانمارکی صورت گرفت، که به عبارت دیگر دانمارکی­ها پیشتاز پرورش ماهی قزل­آلای رنگین کمان برای تغذیه انسانی بودند و سپس در اواخر دهه ی۱۹۶۰ پرورش ماهی قزل­آلا در کانال، توسط آمریکای­ها ابداع شد و در کشورهای دیگر گسترش یافت (فروزانفر، ۱۳۸۴).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱-۴-۲ مشخصات ماهی قزل­آلای رنگین­کمان
قزل­آلای رنگین کمان نخستین گونه از آزاد ماهیان است که به عنوان غذای اصلی انسان رام شد و پرورش یافت. این ماهی در حال حاضر سهم با ارزشی در تأمین غذای انسان دارد. علت این امر فقط ارزش غذایی بالای این ماهی و کمیاب و گران شدن ماهیان وحشی که از طبیعت صید می­شوند نیست، بلکه به این دلیل است که این ماهی­ها غنی از چربی­های اشباع نشده­ای هستند که وجودشان در غذا ضروری است (پاشاپور، ۱۳۸۹) (شکل ۱-۶).
شکل ۱- ۶ ماهی قزل­آلای رنگین کمان (پاشاپور، ۱۳۸۹؛ uk.m.wikipedia.org)
ماهی قزل­آلای رنگین کمان که قبلاً تحت عنوان نام علمی salmo gairdneri خوانده می­شد، به خاطر ویژگی­های ریخت­شناسی خود از جنس salmo جدا و به جنس Oncorhynchus پیوسته و به نام علمیOncorhynchus mykiss خوانده می­ شود که به انگلیسی Rainbow trout می­باشد. انکورینکوس به معنای قلابدار بودن پوزه ماهیان نر است که در اثر رشد عضو قلاب مانند بسیار مشخصی در پوزه این ماهیان در فصل تولید مثل ایجاد می­ شود (پاشاپور، ۱۳۸۹).
۱-۴-۳ جایگاه ماهی قزل­آلا در رده بندی جانوران
ماهی قزل­آلای رنگین کمان از لحاظ رده بندی جزء خانواده آزاد ماهیان[۲۵]، راسته آزاد ماهی شکلان[۲۶] ، زیر رده ماهیان استخوانی حقیقی و رده ماهیان استخوانی است (پاشاپور، ۱۳۸۹).
۱-۴-۴ زیستگاه اصلی ماهی قزل­آلای رنگین کمان
ماهی قزل­آلای­ رنگین­ کمان، بومی حوضه آبریز بخش شرقی اقیانوس آرام از آلاسکا تا مکزیک است. زیستگاه اصلی آن از رودخانه کاسکوکوئیم در آلاسکا شروع شده و به سمت جنوب ادامه یافته و به منطقه باجا در کالیفرنیا می‌رسد.
۱-۴-۴-۱زیستگاه ماهی قزل آلای رنگین­کمان در ایران
تکثیر و پرورش ماهی قزل­آلای رنگین کمان، که یکی از سه گونه خانواده آزاد ماهیان حاضر در ایران می­باشد، از سال ۱۳۳۸ در ایران آغاز شده است و گونه ­ای است که بصورت مصنوعی در آبهای ایران وارد شده و گسترش پیدا نموده است.
ماهی قزل­آلای رنگین کمان در حوضه آبریز دریای خزر، رودخانه‌های دجله، کارون، تجن، دریاچه نمک و بعضی از نقاط انتشار دارد. بطور کلی قزل­آلای رنگین کمان متعلق به آب­های سرد و شفاف، بستر سنگی، سنگلاخی و شنی است. این ماهی در شرایط طبیعی در رودخانه‌ها و دریاچه‌های سرد و خنک زیست می‌کند ((www.fishbase.ir.
۱-۵ بخش پنجم: روش­های شناسایی مخمرها
۱-۵-۱ محیط های کشت کابردی برای تشخیص مخمرها
الف- محیط سابورود[۲۷] آگار (s): حاوی پپتون، دکستروز یا گلوکز و آگار است. ب- محیطSC: با اضافه کردن کلرامفنیکل[۲۸] به میزان ۰٫۰۵ درصد به محیط S حاصل می­ شود که با این غلظت مانع رشد باکتری­ ها در آن محیط می­گردد و لذا رشد قارچ ها در محیط خالص صورت می­گیرد. پ- محیطSCC: با اضافه کردن سیکلوهگزامید[۲۹] به محیط SC حاصل می­گردد. برخی از قارچ های ساپروفیت ممکن است بعنوان آنتاگونیست رشد در مقابل قارچ های بیماریزا عمل کنند که سیکلوهگزامید مانع رشد قارچ های ساپروفیت علاوه بر باکتری های مزاحم می­ شود. قارچ های پاتوژن نظیر: درماتوفیت­ها، برخی گونه­ های مخمر کاندیدا و قارچ­های دوشکلی بیماریزا معمولاً در محیطSCC قادر به رشد هستند (دیبا، ۱۳۹۰). ت- محیط CHA[30] که حاوی سوبستراهای کروموژنیک می­باشد، رنگ­های منحصر به فرد و مخصوصی برای شناسایی تولید می­ کند.
بر اساس مطالعات انجام شده در محیط کشت CHA رنگ کلنی­های Candida albicans سبز روشن، dubliniensis Candida سبز تیره، Candida tropicalis آبی تیره مایل به بنفش (Coleman et al., ۱۹۹۷; Kirkpatrick et al., ۱۹۹۸; Sullivan et al.,1998) و کلنی­های Candida krusei به رنگ قرمز روشن با حاشیه های سفید می­توانند تظاهر یابد (larone , 1939). حصول نتایج موفق در شناسایی مخمرهای فوق با بهره گرفتن از محیط­های کشت اختصاصی موجب شده است که بتوان با اطمینان بیشتری جهت شناسایی تعدادی از مخمرهای تک سلولی با بهره گرفتن از محیط­های کشت، بدون استفاده از روش­های مولکولی اقدام نمود. به طور مثال Candida glabrata می ­تواند در محیط کشت CHA کلنی های صورتی مایل به بنفش تشکیل می­دهد اما نمی­تواند با این روش به صورت قطعی جهت شناسایی آنها از دیگر جنس­ها و یا گونه­ های مخمر اقدام نمود.
بسیاری از محققان دریافتند که استفاده از محیط کشت CHA برای شناسایی احتمالی مخمر Candida albicans، Candida tropicalis و Trichosporon به کار می­رود (Odds&Bernaerfs, 1994؛San-Millan et al, 1996). Pfaller و همکارانش نیز دریافتند که این محیط می ­تواند برای شناسایی Candida glabrata روش قابل اعتمادی باشد. این در حالی است که تعدادی از محققین با بیان این نکته که Candida glabrata توسط کشت در محیط CHA به تنهایی قابل شناسایی نیست و ظاهراً شبیه به Candida parapsilosis، Saccharomyces cerevisiae، P. wickerhamii، Cryptococcus neoformans وC.guilliermondii ایجاد می­ کند با نظر فوق موافق نبودند (Odds&Bernaerfs, 1994 ؛San-Millan et al, 1996). به هر حال وجود ویژگی­های خاصی از جمله تولید رنگدانه آنچنانکه در کلنی­های C. tropicalis درمحیط CHA دیده می­ شود می ­تواند در شناسایی موثر باشد (Odds&Bernaerfs, ۱۹۹۴).
ج– محیط اختصاصی [۳۱]CMAنیز برای شناسایی بیشتر مخمرها استفاده می­ شود. مخمرها به روش جوانه زدن تولید مثل می­ کنند. ادامه عمل جوانه زنی از یک طرف یا دو طرف مخمر منجر به ایجاد مجموعه هایی از سلول­های متصل به هم می­ شود و نهایتاً اشکال خوشه­مانند بنام بلاستوکونیدی یا بلاستوسپور را می­سازد. گاه در نتیجه­ رشد و طویل شدن برخی جوانه­ ها، اشکال هایف­مانند بدون تیغه­های میانی ایجاد می­گردد و هایف کاذب یا سودوهایف نامیده می­ شود؛ در محیط CMA ظاهر میکروسکوپی این اشکال بسته به گونه مخمر بسیاراختصاصی می­باشد. البته شناسایی قطعی گونه­ های مخمرها نیازمند تست­های بیوشیمیایی و مورفولوژیک مفصل­تری است (دیبا، ۱۳۹۰) (شکل ۱-۷ و ۱-۸).
شکل۱- ۷ سودوهایف مخمر ()
شکل ۱- ۸ کلنی های رشد یافته در محیط CHA و CMA
(D) T. beigelii. (E) C. krusei. .(A) C. albicans. (B) C. dubliniensis. © C. tropicalis
(F) C. glabrata. (G) C. parapsilosis. (H) C. neoformans. (I) C. guilliermondii.
(et al., ۱۹۹۹ Koehler) (J) S. cerevisiae. (K) P. wickerhamii.
۱-۵-۲ بررسی رشد کلنی مخمرها در محیط کشت جامد و مایع
مطالعات متعددی درباره کلنی باکتری­ ها و قارچ­های رشته­ای صورت گرفته اما توجهات بسیار ناچیزی به کلنی­های مخمر­ها شده است. Pirt در سال۱۹۶۷ فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی موثر در سرعت رشد کلنی­ها را در محیط کشت جامد مشخص کرده است (Cooper et al, 1968؛ Wimpenny , 1979؛ Wimpenny&Parr, 1979).
مطابق با تحقیقات Pirt، زمانیکه مواد مغذی انتشار طولانی در مسیر رو به بالای کلنی داشته باشند، رشد به مناطق بیرونی (محیطی) کلنی محدود می­ شود. Reyrolle و Letellier در سال ۱۹۷۹ دو منطقه­ رشد، منطقه­ محیطی (مسئول افزایش قطر) و یک منطقه­ مرکزی (مسئول افزایش ارتفاع) را یافتند. در منطقه­ محیطی عامل اصلی برای رشد، تحرک بود. افزایش تقریباً خطی در ارتفاع کلنی­ها که بعدها پایین می­آیند، در طول دوره­ قبل از رشد گزارش شده است (Wimpenny , 1981).
Wimpenny و Lewis در سال ۱۹۷۷ میزان مصرف واقعی اکسیژن را برای پیش بینی عمق نفوذ اکسیژن به داخل کلنی­ها بررسی کردند. میزان اکسیژن در کلنی­ها و محیط کشت جامد با بهره گرفتن از میکرو الکترود­ها اندازه ­گیری شد (Wimpenny&Coombs, 1983؛ Bungay et al, 1983).
Wimpenny در سال ۱۹۸۱گزارشی مبنی بر تنوع در اندازه و میزان رشد کلنی­ها با توجه به در دسترس بودن اکسیژن و شرایط مختلف تغذیه­ای ارائه داد. همچنین Fraleigh و Bungay در سال ۱۹۸۶میزان اکسیژن و شیب سوبسترا را در کلنی­ها طراحی کردند (Cooper et al, 1968). کلنی سویه­های هوازی مصرف کننده­ گلوکز (منبع کربن و انرژی) محیط کشت بوده، در حالی که اکسیژن (گیرنده­ی نهایی الکترون) از فاز گازی منتشر می­یابد.
Fraleighدر سال ۱۹۸۵ به دنبال غلبه بر مدل Gray and Kirwan شبیه سازی اکسیژن و شیب گلوکز در یکی از کلنی­های میکروبی با بهره گرفتن از روش دوبعدی و همچنین با توجه به دو بستر (گلوکز و اکسیژن)، سنتیک­های رشدی محدود می­ شود. او همچنین از بخش کروی شکل کلنی استفاده کرد.
۱-۵-۳ محیط کشت جامد یا مایع اختصاصی مخمرها
مخمرها می­توانند در محیط کشت مایع و یا سطح آگار جامد رشد کنند. سلول­های مخمر در محیط کشت حداقل حاوی دکستروز (گلوکز) به عنوان منبع کربن و نمک، که تامین کننده­ نیتروژن، فسفر و مقدار کمی از فلزات است، رشد می­ کنند.
سلول­های مخمر به سرعت در حضور محیط کشت غنی که شامل معرف­هایی مانند عصاره مخمر و پپتون می­باشند، رشد می­ کنند. این موضوع بسیاری از متابولیت­ها را زمانیکه سلول تحت شرایط رشد حداقل است، سنتز می­نماید (www.springer.com).
در فاز لگاریتمی رشد در محیط کشت غنی، سلول­های مخمر تقریباً هر ۹۰ دقیقه یکبار تقسیم می­شوند. اوایل فاز لگاریتمی، دوره­ای است که تراکم سلول کمتر از ۱۰۷ سلول بر میلی لیتر است. اواسط فاز لگاریتمی دوره­ای است که در این زمان تراکم سلولی بین ۱×۱۰۷ و ۵ ×۱۰۷سلول بر میلی لیتر است و فاز لگاریتمی تاخیری (نهایی) زمانی اتفاق می­افتد که تراکم سلولی بین ۱۰۷×۵ و ۱۰۸×۲ سلول بر میلی­لیتر است (www.springer.com).
تیپ وحشی مخمر در دمای ۳۰ درجه با هوادهی خوب و گلوکز بعنوان منبع کربن رشد می­ کند همچنین می ­تواند از انواع منابع کربن بجز گلوکز استفاده کند. بطور خاص از رافینوز و گالاکتوز تحت شرایطی برای از بین بردن سرکوب گلوکز (در مورد رافینوز) و یا برای القاء بیان پروموتر وابسته به Gal4p مانند GAL1 و GAL10استفاده می­ شود. همه آنها در غلظت (wt/vol) (20 g/L)2% استفاده شده و برای جایگزینی دکستروز محیط کشت مشخص یا غنی کاربرد دارد (www.springer.com).
۱-۵-۴ تعیین تراکم سلولی (بهترین روش برای اندازه گیری تعداد سلول های مخمری)
تعداد تقریبی سلول­ها در یک محیط کشت را می توان با دستگاه اسپکتروفتومتر با اندازه ­گیری چگالی نوری (OD) درطول موج ۶۰۰ نانومتر بدست آورد. محیط کشت باید رقیق شود بطوریکه مقدار مشاهده شده (OD600) کمتر از ۱ شود. در این محدوده یعنی OD600 = ۱٫۰تقریباً برابر با ۳×۱۰۷ سلول بر میلی لیتر است. با این حال، دراین اندازه ­گیری تنوع سویه­ای وجود دارد و یا ممکن است بیان محصول ژن خاص در یک سویه تحت تاثیر قرار بگیرد.
بهترین کار برای تعیین نمودار OD600 به عنوان تابعی از سلول­های واقعی، شمارش با هموسیتومتر است. بسیاری از روش های استفاده از ترانسفورماسیون و رشد مخمر در محیط کشت به تراکم سلولی خاص قبل از برداشت (محصول دادن) بستگی دارد (www.springer.com).
۱-۵-۵ حفظ و تقویت سویه
سویه­های مخمر را می­توان در دمای ۷۰- درجه در گلیسرول ۱۵% ذخیره سازی نمود و برای مدت طولانی (بیش از ۳ سال) نگه داشت. به صورت متناوب، می توان آنها را در دمای ۴ درجه بر سطح محیط کشت غنی به مدت ۶ ماه تا ۱ سال نگه داشت (www.springer.com).
۱-۵-۶ اسپور زایی بر روی پلیت یا محیط کشت مایع
احتیاج سلول­های دیپلوئید به منبع نیتروژن و کربن سبب انجام میوز و تشکیل اسپور خواهد شد. اسپورزایی را می­توان در سلول­های رشد یافته در محیط کشت جامد و یا مایع مشاهده نمود. با این حال ممکن است سویه­های خاصی در محیط کشت جامد یا مایع سبب تشکیل اسپورهای بهتری شوند.
سلول­هایی که در محیط انتخابی رشد کرده اند، به مدت ۳ تا ۵ روز در دمای ۲۵ درجه انکوبه شده چراکه اسپورزایی معمولاً در دماهای بالاتر کارایی چندانی ندارد. بطور کلی تشکیل اسپور بدلیل وجود تتراد (خوشه­های چهار­تایی داخل آسک) با میکروسکوپ (۴۰۰-۲۵۰×) دیده شد. نسبت اسپورزایی از گونه ­ای به گونه­ دیگر متفاوت است.
همانگونه که گفته شد برخی گونه­ ها در محیط کشت مایع، بهتر اسپورزایی می­ کنند. اغلب اسپورزایی در محیط کشت مایع در مدت زمان ۴۸ ساعت به اتمام می­رسد. به طور خلاصه سلول­ها در محیط کشت انتخابی تا اواخر فاز لگاریتمی یا اوایل فاز ثابت، رشد می­ کنند (www.springer.com).
۱-۵-۷ فرمولاسیون محیط های کشت در سیتم های دی هیبریدی

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...